СОДЕРЖАНИЕ
Введение..............................................................4
1. Обзор литературы....................................................9
1.1. Структурная, морфологическая, генотипическая и иммунологическая
характеристика ВЛКРС...................................................9
1.2. Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота...............19
1.2.1. Серологические методы диагностики..............................19
1.2.1.1. Реакция иммунодиффузии в геле агара..........................19
1.2.1.2. Иммуиоферментный анализ, как альтернатива РИД................26
і .2.1.3. Иммуноблотииг...............................................33
1.2.1.4. Причины выпадения серологических реакций.....................36
1.2.2. Молекулярные методы диагностики................................38
1.2.2.1. Полимеразная цепная реакция..................................39
1.2.2.2. Способы оптимизации и особенности проведения ГИДР............44
Заключение по обзору литературы.......................................48
2. Собственные исследования...........................................52
2.1. Материалы и методы исследований..................................52
2.2. Результаты исследований..........................................57
2.2.1. Сопоставление результатов диагностических исследований крупного рогатого скота на инфекцию вируса лейкоза в РИД и ИФА.................57
2.2.2. Сравнительное изучение эффективности тест-систем на основе ПЦР...................................................................66
2.2.3. Роль и место ИФА и ПІДР в системе общепринятых методов диагностики инфекции ВЛКРС и оптимизации схемы оздоровительно -профилактических мероприятий..........................................71
3. Обсуждение результатов собственных исследований....................78
4. Выводы.............................................................87
5. Практические предложения...........................................89
Список литературы.....................................................90
Приложение..........................................................121
АББРЕВИАТУРА, ИСПОЛЬЗОВАННАЯ В ДИССЕРТАЦИИ
АГ - антиген АТ - антитело
BJ1KPC (BLV) - вирус лейкоза крупного рогатого скота ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА (ELTSA) - иммуиофермснтный анализ (enzym linked immunosorbent assay)
ЛКРС - лейкоз крупного рогатого скота МКА - моноклональные антитела
o.e. - оптические еденицы (EU - международные ИФА еденицы)
п.н. (Ьр) - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РИД - реакция иммунодиффузии в геле агара
РНК - рибонуклеиновая кислота
FLK-BLV - fetal lamb kidney (персистентно продуцирующая ВЛКРС клеточная культура почки эмбриона овцы)
«nested»-ni4P - ПЦР с двумя парами праймеров «single»-nL[P - ПЦР с одной парой праймеров
Геном вируса может существовать в 2-х формах: геномной 1-цепочечной РНК или в виде ДНК, синтезированной на геномной РНК как на матрице, и интегрированной в хромосому клетки-хозяина в виде провируса. Геномная РНК содержится только в зрелых вирионах. В жизненном цикле вируса геномная РНК функционирует лишь 1 раз, когда служит матрицей для фермента - обратной транскриптазы при биосинтезе комплементарной ДНК. Весь объем биохимических процессов, необходимый для полной репликации вируса, выполняется с участием ДНК-провируса (В.Л. Сергеев и Б.Г. Орлянкин, 1983; В.Н. Сюрин и соавг., 1998; В.А. Бусол и соавт., 1999; J. Cihysdael et al., 1978, 1979; J. Deschamps et al., 1981).
N. Sagata et al. (1985) описали полную нуклеотидную последовательность ВЛКРС, изолированного от крупного рогатого скота с лимфосаркомой в 1983 г. (N. Sagata et al., 1983). Согласно N. Sagata et al. (1985) геном ВЛКРС состоит из 8714 нуклеотидов. Он имеет следующую структуру; 5'LTR-gag-prt-pol-env-X-3'LTR (N.R. Rice et al., 1984, 1985; N. Sagata et al., 1985; J. Coulston et al., 1990; S. Alexanderseii et al., 1993).
8714
8 Г 85 3* LTR 8172
.V 6742
636К
4V>1 vnv 4875
■>\m\ /ЮІ 2317
гш prt 1806
530 0 looo Ья 628 .
S’ LTR 1 і
Рисунок 1. Структура генома ВЛКРС.
12
Ген gag кодирует трансляцию группоспецифпческого белка предшественника структурных белков, в частности р24; ген pol- полимеразу, которая транскрибируется с ДНК в составе общего с геном gag транскрипта "gag-pol". В результате процессинга получаются следующие продукты: обратная транскрнптаза 66-55 кД, протеаза 10 кД, эндонуклеаза 15 кД; ген env - кодирует трансляцию белка предшественника гликозилированных белков наружной оболочки вируса; ген X - трансактиватор транскрипции (tat), кодирует регуляторные трансактиваторные белки (A. Menard et al., 1993; L. Lefebvrc et al., 2002a, b). Гены env, gag и pol называют структурными, так как кодируемые ими белки являются структурными белками зрелого вируса или ферментами.
Два длинных концевых повтора (Long Terminal Repeats (LTR)) состоят из 530 пар нуклеотидов (п.н.) по N. Sagata et al. (1984), 531 п.н. по J. Coulsten et al. (1990) и соответственно 535 п.н. по D. Couez et al. (1984) с обратным повтором в 6 пар оснований на 5'- и 3'- концах, фланкированных прямыми повторами в 6 пар оснований из ДНК клетки хозяина (В.Ю. Луговцев и Д.А. Васильев, 2002; N. Sagata et al., 1984; D. Derse et al., 1985, 1988).
Варианты ВЛКРС и значение мутаций 6 их структуре
Для РНК-вирусов, в частности ретровирусов, характерна изменчивость генома (R. Johnson et al., 1994). L. Willems et al. (1993a, b) установили для env гена BJIKPC норму мутации (замена нуклеотида) не менее 0,009% в год, а для LTR - 0,034% в год. Так, например, у вируса иммунодефицита человека (HIV) не достаточно механизмов для исправления ошибок во время репликации, что приводит к изменениям в геноме и репликационном цикле вируса. Таким образом, каждый вирусный геном отличается от другого. Различные мутации могут приводить к изменению биологических свойств вируса. Как раз изменчивость антигенов позволяет вирусу противодействовать иммунной системе организма хозяина (C. Chcng-Meyer et al., 1991).
- Київ+380960830922