2
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ..............................................................6
1.1. Актуальность работы.................................................6
1.2. Цель и задачи исследований..........................................7
1.3. Научная новизна.....................................................7
л 1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследований....:..8
1.5. Апробация работы....................................................9
1.6. Публикации..........................................................9
1.7. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту...9
1.8. Личный вклад соискателя.............................................9
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................10
2.1. Классическая чума свиней: вирус, болезнь, диагностика и специфическая профилактика.......................................................10
2.1.1. Современная таксономия, патогенность вируса......................10
2.1.2. Болезнь, патогенез, иммунитет....................................11
* 2.1.3. Лабораторная диагностика.........................................13
2.1.3.1. Обнаружение вируса и вирусного антигена.....................-..13
2.1.3.2.0бнаружение вирусспецифических антител..........................16
2.1.4. Вакцины..........................................................17
2.2. Современные особенности эпизоотического процесса классической чумы свиней.............................................................19
2.2.1. Глобальная эпизоотическая ситуация в мире и странах ЕС..........1.9
•
2.2.2. Основные эпизоотологические показатели КЧС в РФ..............21
, 2.2.2.1. Инцидентность и географическое распространение КЧС среди
домашних свиней.........................................................24
2.2.2.2. Эпизоотология КЧС среди кабанов................................24
2.2.3. Источники и пути передачи вируса КЧС.............................25
2.3. Стратегии борьбы с классической чумой свиней.......................28
2.3.1. Контроль КЧС среди домашних свиней в Европе......................29
2.3.2. Стратегия без применения вакцинации..............................29
2.3.3. Альтернативная стратегия, основанная на«не-вакцинации»..............31
2.3.4. Стратегия, включающая чрезвычайную вакцинацию......................31
2.3.5. Меры борьбы с КЧС среди диких кабанов..............................32
3.0. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................35
3.1. Материалы и методы....................................................35
3.1.1. Материалы...........................................................35
3.1.1.1.Виру с.............................................................35
3.1.1.2. Вакцины...........................................................35
3.1.1.3. Животные.........................................................35
3.1.1.4. Культуры клеток...................................................35
3.1.1.5. Питательные среды, сыворотка.....................................35
3.1.1.6. Основные реактивы, приборы.......................................36
3.1.2. Методы..............................................................36
3.1.2.1. Основные методы эпизоотологического исследования..................36
3.1.2.2. Методы учёта количества и плотности обитания кабанов..............36
3.1.2.3. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней..........37
3.1.2.4. Методы определения напряжённости иммунитета против классической чумы свиней.........................................................37
3.1.2.5. Определение форм течения болезни.................................37
3.1.2.6. Статистические методы обработки результатов..................*....38
3.2. Результаты исследований..............................................38
3.2.1. Природно-географические и экономические условия развития свиноводства Волгоградской области, имеющие эпизоотологическое значение при 1 классической чуме домашних свиней и диких кабанов..........................38
3.2.2. Локализация и популяция диких кабанов...............................43
3.2.3. Эволюция классической чумы среди домашних свиней и диких кабанов....................................................................47 •
3.2.3.1. Общая эпизоотическая ситуация и главные индикаторы проявления классической чумы свиней в период с 1980-2003 г.г. в РФ и Волгогра- •
г
декой области............................................................ 47
3.2.3.2. Районированние, инцидентность и географическая локализация , . вспышек КЧС среди домашних свиней и диких кабанов......................................................52
цированных штаммов, маловероятна циркуляция пестивирусов жвачных у свиней, однако существует необходимость дифференциации полевого и золя та от вакцинного вируса.
Самым существенным при использовании метода, несмотря на его дороговизну, является единственная возможность выделения новых, в том числе, "непредвиденных" штаммов вируса.
Для дифференцирования вируса КЧС от пестивирусов жвачных животных обычно используют моноклональные антитела (40, 75, 76, 81, 91, 100, 101, 104, 105, 130, 166). Быстрый и чувствительный метод для обнаружения вируса КЧС основан на визуализации вирусного антигена в ,срезах тканей органов, с использованием реакции прямой иммунофлуоресценции (7, 31, 33). Метод оказался наиболее пригодным и признанным для экспрессной лабораторной диагностики КЧС во всех лабораториях мира и странах, которые успешно провели ликвидацию болезни (191,200, 219). Чувствительность метода зависела от правильности отбора проб, стадии болезни, формы течения инфекции и вирулентности вируса. Так, при исследовании проб от заражённых свиней при полевых вспышках КЧС чувствительность составляла 77 - 95%, а проб, полученных при экспериментальном заражении -100% (30). Несмотря на высокую чувствительность метода, существуют и определённые недостатки. Одним из основных является проблема дифференциации полевых и вакцинных штаммов, в частности, при исследовании проб, полученных от вакцинированных свиней.
Для скрининга большого числа животных в подозреваемых стадах при недавнем подозрении инфицированости свиней вирусом КЧС, для обнаружения антигена могут использоваться варианты твердофазного им.мунофер-ментного анализа (6, 96, 101, 189, 203). Однако, этот метод менее чувствителен по сравнению с методом вирусной изоляцирії (93, 127, 142, 143).
Недавно разработанный метод обнаружения вирусной РНК стал дополнительным для лабораторного диагноза (70, 100, 101, 112, 119, 140, 170). Основная методология, которую используют для целей диагностики, .основана на синтезе кДНК, комплементарной вирусной РНК с последующей её
амплификацией полимеразной цепной реакцией-ОТ-ПЦР (121, 183).
Метод молекулярной гибридизации НК (дот-гибридизации), основанный на
11,^*
использовании ДНК-зондов с радиоактивной или нерадиоактивной (перок-сидаза хрена) маркерами, комплементарных вариабельному или консервативному регионам участков генома, кодирующих структурные или неструктурные белки, также испытан для диагностических целей (23), однако в последнее время его чаще применяют для идентификации продуктов амплификации.
На основании анализа структуры генома пестивирусов разрабатывали ОТ-ПЦР как для обнаружения вирусной РНК, так и дифференциации пестивирусов. Для этого использовали праймеры к структурным (150, 161) и неструктурным белкам (121, 152, 153).
В результате исследования проб органов, полученных от больных свиней, чувствительность ОТ-ПЦР составила Ю4,0 ККИД50, при дополнительной амплификации с использованием гнездовых праймеров чувствительность метода удалось повысить в 1000 раз (140, 154). При исследовании проб крови от заражённых вирусом КЧС поросят ОТ-ПЦР с использованием "внешних" праймеров положительный результат был получен на 6-е су-тки и «внутренних» - на 4-е сутки (213). Поскольку метод позволяет)обнаруживать несколько вирусных частиц, то при проведении амплификации должны быть созданы необходимые условия для исключения л^жно-положительных результатов, обусловленных случайной контаминацией вирусной РЫК или кДИК исследуемых проб, используемых буферных растворов или праймеров (11).
Секвенирование нуклеотидов соответствующей области генома позволило устанавливать различие между различными изолятами вируса КЧС, в том числе, между полевыми и вакцинными штаммами (114, 121, 141, 142, 115, 116, 125, 193) и пестивирусами жвачных (210, 211, 218). В референс-лаборатории Европейского Союза МЭБ по КЧС (г. Ганновер, Германия),' имеется большая компьютерная база данных на изоляты вируса КЧС, вклю-
- Київ+380960830922