ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Экспериментальные животные
Исследования проведены на 158 крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г в осенне-зимний период. Животные находились в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище согласно рекомендаций [302]. Изучаемыми параметрами были: вес животных, потребление пищи и воды, концентрация глюкозы и инсулина в крови; образование холецистокинина-8 нейронами гипоталамуса, синтез гормонов панкреатическими островками.
2.2. Серии экспериментальных исследований
На первом этапе работы для изучения состояния ХЦК-8-синтезирующей системы гипоталамуса в норме и при сахарном диабете нами проведена иднетификация и изучение параметров иммунопозитивных нейронов, волокон и терминалей в срезах мозга в трех экспериментальных сериях (табл. 2.1): у здоровых животных, к концу 3 недели и к концу 5 недели развития сахарного диабета.
В дальнейшем с целью изучения влияния введений синтетического ХЦК-8 и блокатора его рецепторов проглюмида на состояние ?-, ?- и ?-клеток панкреатических островков нами было проведено 13 серий экспериментальных исследований (см. табл. 2.1): десятикратные внутримозговые (интрацеребровентрикулярные) и внутрибрюшинные (интраперитонеальные) введения 0,9% р-ра NaCl здоровым и диабетическим крысам (№№ 1, 2, 8, 9), внутрибрюшинные, внутримозговые и конъюнктивальные введения ХЦК-8 здоровым и диабетическим крысам (№№ 3, 4, 5, 10, 11, 12), а также внутрибрюшинные введения проглюмида здоровым и диабетическим животным (№№ 6, 13). Отдельно было изучено состояние эндокринной функции поджелудочной железы в группе крыс с трехнедельным сахарным диабетом (№7).
Таблица 2.1
Серии экспериментальных исследований
Название серии исследованийКоличество животныхИзучение ХЦК-8-синтезирующей системы гипоталамуса у крыс с предварительным введением колхицина1. Интактные животные (контроль)122. Сахарный диабет, 3 недели113. Сахарный диабет, 5 недель10Изучение влияния многократных введений синтетического ХЦК-8 и проглюмида на состояние ?- и ?-клеток панкреатических островков1. Внутрибрюшинные введения 0,9% р-ра NaCl здоровым животным (контроль)102. Внутримозговые введения 0,9% р-ра NaCl здоровым животным (контроль)93. Внутрибрюшинные введения ХЦК-8 здоровым животным104. Внутримозговые введения ХЦК-8 здоровым животным95. Конъюнктивальные инстилляции ХЦК-8 здоровым животным106. Внутрибрюшинные введения проглюмида107. Животные с 3-недельным сахарным диабетом без введений108. Внутрибрюшинные введения 0,9% р-ра NaCl животным с 25 по 35 день диабета99. Внутримозговые введения 0,9% р-ра NaCl животным с 25 по 35 день диабета810. Внутрибрюшинные введения ХЦК-8 животным с 25 по 35 день диабета1011. Внутримозговые введения ХЦК-8 животным с 25 по 35 день диабета912. Конъюнктивальные инстилляции ХЦК-8 животным с 25 по 35 день диабета1113. Внутрибрюшинные введения проглюмида животным с 25 по 35 день диабета9Всего животных158
2.3. Моделирование сахарного диабета 1 типа
В настоящем исследовании нами использовалась стрептозотоциновая модель сахарного диабета, которая является широко признанной и наиболее используемой в исследованиях последних лет благодаря высокой специфичности и ?-цитотропности стрептозотоцина, отсутствию выраженного побочного действия, хорошей зависимости доза-эффект и высокой степени соответствия модели инсулинзависимому сахарному диабету человека [15, 303].
Стрептозотоцин производства Sigma-Aldrich (США) вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Указанную дозу стрептозотоцина ex tempore растворяли в 0,5 мл 0,1М цитратного буфера (pH 4,5). Выбор дозировки и способа введений осуществлен на основании предыдущих исследований кафедры в течение более десяти лет [15, 304, 305] и анализа данных ряда иностранных авторов [306, 307, 308]. День введения препарата здесь и в дальнейшем упоминается как первый день развития сахарного диабета.
2.4. Методика измерения потребления пищи и воды экспериментальными животными
Количество потребленного корма учитывалось посуточно как разница между помещенным в кормушку кормом и его остатком на следующий день. Кормовые остатки повторно не использовались, а полностью удалялись из клеток и выбрасывались. Потребление воды учитывали путем посуточного измерения количества выпитой жидкости из стеклянных поилок с пипетками.
2.5. Методы изучения состояния ХЦК-8-синтезирующей системы гипоталамуса
Выявление ХЦК-8-содержащих нейронов, нервных волокон и терминалей осуществляли в серийных срезах гипоталамуса методом непрямой иммунофлюоресценции. Для улучшения идентификации за 48 часов перед забоем наркотизированным крысам после фиксации в стереотаксическом аппарате THORAX (Венгрия) в латеральный желудочек мозга вводилось 120 мкг колхицина (Sigma-Aldrich, США), растворенного в 20 мкл цитратного буфера (pH 4,5).
Декапитация осуществлялась на фоне 16-частового голодания после внутрибрюшинного введения этаминала натрия в дозе 40 мг/кг. Наркотизированных животных перфузировали через нисходящую аорту фиксатором Буэна, быстро извлекали мозг и помещали в тот же фиксатор на 24 часа при комнатной температуре. После стандартной гистологической процедуры обезвоживания и заливки в парафин на автоматизированном ротационном микротоме Micron (Micron, Германия) получали серийные фронтальные срезы гипоталамуса толщиной 14 мкм.
В среднем для одного гипоталамуса анализировалось порядка 25-30 срезов. В последовательных серийных срезах нами были исследованы структуры переднего, медиобазального и латерального отделов гипоталамуса, а именно супрахиазматическое, супраоптическое ядро, передняя гипоталамическая область, ретрохиазмальная область, крупно- и мелкоклеточные субъядра паравентрикулярного ядра (переднее, медиальное, заднелатеральное и заднемедиальные крупноклеточные и переднее, медиальное, латеральное, дорсальное и перивентрикулярное мелкоклеточное), субъядра аркуатного ядра (дорсомедиальное, вентролатераль
- Київ+380960830922