Ви є тут

Дослідження квантових властивостей синаптичного вивільнення ГАМК в культурі кори головного мозку щура.

Автор: 
Палигін Олег Олександрович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2004
Артикул:
0404U003709
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Для исследования синаптической передачи в культуре нейронов коры головного мозга крыс применялись следующие экспериментальные подходы:
1. приготовление первичной диссоциированной культуры нейронов коры низкой плотности;
2. метод внутриклеточной фиксации потенциала на постсинаптическом нейроне в конфигурации "целая клетка"
3. методика внеклеточной электрической стимуляции напряжением аксона пресинаптического нейрона;
4. метод локальной внеклеточной суперфузии для приложения блокаторов тормозной синаптической передачи;
5. методика внеклеточной электрической стимуляции напряжением единичной нервной терминалии пресинаптического нейрона;
6. математические методики обработки результатов и построения квантовой модели.
2.1 Получение первичной диссоциированной культуры нейронов коры низкой плотности
Для приготовления культуры были использованы новорожденные крысы линии Вистар. Животных декапитировали, головной мозг помещали в минимальную среду Игла ("Sigma", США), с добавлением 20 мM HEPES, 25 ед/мл натриевой соли бензилпенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина сульфата. Кору отделяли с помощью скальпеля и помещали в минимальную среду Игла, описанную выше, после нарезали на кусочки толщиной около 0,5 мм. Ферментативная обработка осуществлялась 0,05%-ым раствором трипсина (тип XII-S, "Sigma", США) при комнатной температуре (23 - 25?С). После достижения нужной степени диссоциации ткань промывали в 10 мл культуральной среды, в состав которой входили: минимальная среда Игла, 10% лошадиной сыворотки, 6 мкг/мл инсулина, бикарбонатный буфер (2.2 г/л NaHCO3), натриевая соль бензилпенициллина - 25 ед/мл, стрептомицина сульфат - 25 мкг/мл. Суспензию клеток необходимого отдела мозга получали с помощью диссоциации пластиковыми пипетками последовательно уменьшающегося диаметра.
Клетки помещали на чашки Петри, предварительно обработав их поли-L-орнитином. Мы наливали по 100 мкл каждой суспензии в стеклянное кольцо диаметром 0,9 мм. Чашки Петри с суспензией клеток помещались в инкубатор ("Jouan", Франция), содержащий воздушно-газовую среду, обогащенную СО2 (5%), и поддерживающий температурный режим 37?С. На третий день культивирования в среду добавляли 5 мкМ цитозин-A-D-арабино-фуранозида ("SIGMA", США) для подавления пролиферации глиальных клеток. Режим обработки культуры цитозин-A-D-арабино-фуранозидом был подобран экспериментально таким образом, чтобы подавить пролиферацию глиальных клеток в такой стадии, на которой количество астроцитов было достаточным для образования глиального монослоя. Полная смена среды проводилась через 20 - 24 часа.
Электрофизиологические исследования проводились на 10-й - 15-й день культивирования при комнатной температуре (20 - 23?С). К этому времени клетки образовывали достаточное количество синаптических контактов для электрофизиологических исследований, а также различные типы клеток к этому времени могли быть хорошо идентифицированы (рис 2.1)
Рис. 2.1. Диссоциированная культура нейронов коры низкой плотности. На фотографии видно пирамидный большой нейрон и малый звездчатый интернейрон, образующий тормозные синаптические контакты на пирамидном нейроне (12 дней культуре, DIC ? 63, n.a. 0.9, Olympus B?50WI).
2.2 Покрытие стёкол поли-L-орнитином
Стёкла обрабатывались в течение 24 часа в спирте (96%) и эфире (1:1), затем промывались дистиллированной водой и стерилизовались в жарочном шкафу при 180?С в течение 2 часов. Стёкла помещали в стерильные чашки Петри диаметром 35 мм, и на каждое стекло капали 0,5 мл 0,1% раствора поли-L-орнитина, растворённого в 150 мМ боратном буфере (рН=8,35). Стёкла инкубировались в поли-L-орнитине в течение 0,5 часа при комнатной температуре. После этого чашки промывались в 10 мл дистиллированной воды. Покрытые чашки хранились при 2-5?С в течение 2-3 месяцев.
2.3 Растворы и реактивы
Внеклеточный базовый раствор для исследования тормозных постсинаптических токов вызванных электрической стимуляцией аксона содержал (в мM): NaCl - 140, KCl -3, CaCl2 - 2, МgCl2 - 2, глюкоза - 30, HEPES - 20, доводился до 7.4 добавлением Na-OH. Во внеклеточный раствор добавлялись блокаторы NMDA- и не NMDA-рецепторов DNQX - 20мкМ и D-APV - 20мкМ и в случае работы на культуре коры также блокаторы мускариновых и никотиновых рецепторов атропин - 1мкМ и тубокурарин - 20мкМ. При исследовании тормозных постсинаптических токов вызванных электрической стимуляцией одиночной терминалии во внеклеточный раствор, ко всему сказанному выше добавляли, 0.25 мкМ ТТХ, спонтанные миниатюрные постсинаптические токи измерялись при всех перечисленных блокаторах с удалением из внеклеточного раствора Са2+.
Внутриклеточный раствор для пэтч-пипетки содержал во всех случаях (в мM): K-глюконат - 100, KCl - 50,EGTA - 5, MgCl2 - 5, HEPES - 20, доводился до 7.4 добавлением К-OH.
Все реактивы получены от Sigma.
2.4 Метод фиксации потенциала в конфигурации "целая клетка"
Для измерения трансмембранных культивируемых нейронов гиппокампа и коры головного мозга был применен метод фиксации потенциала в конфигурации "целая клетка", описанный ранее [75]. Поддерживаемый потенциал во всех случаях составлял - 80 мВ.
2.5 Система подачи растворов
Для идентификации рецепторов, участвующих в синаптической передаче, осуществлялась быстрая локальная суперфузия участка площадью 70-100 мкм2. Это позволяло апплицировать блокатор ГАМКА-рецепторов бикукуллин в концентрации 50 мкМ на участок, в пределах которого находилась одна пара исследуемых нейронов.
Также аппликация других исследуемых веществ производилась на одну или обе выбранные клетки с помощью системы локальной суперфузии, разработанной специально для работы с монослойной клеточной культурой Веселовским и др.[62, 211].

Рис. 2.2. Система быстрой локальной аппликации веществ. +P - положительное давление, -P1-3 - три различных уровня отрицательного давления; 1- настройка аппликации, 2 - аппликация на клетку отключена, 3 - аппликация н