РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ РОБОТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконувалась упродовж 1998 - 2006 років у лабораторії токсикологічного моніторингу Центру токсикологічних досліджень, ветсанекспертизи, сертифікації кормів та продуктів тваринництва ННЦ "Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини" за схемою, наведеною на рис. 2.1.
Виконання експериментальної частини базувалося на загально визнаних методах досліджень як вітчизняних, так і зарубіжних учених.
Ми провели дослідження щодо вдосконалення методики визначення залишків дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії Метод, який і сьогодні використовується в лабораторіях, наведено в "Методических указаниях по определению синтетических пиретроидов (амбуш, децис, рипкорд, сумицидин) в растениях, почве, воде водоемов методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии", розроблені Д.Б. Гіренко, М.А. Клісенко та ін., затверджені 22.10.81, № 2473 - 81.
Відповідно до стандарту "ІSO 5725-1:1994" та "Європейської інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЄС 657/2002" ми визначили валідаційні характеристики вдосконаленого методу, які включали встановлення точності, відтворюваності й надійності результатів у аналітичних дослідженнях, що підтверджують характеристики застосованих методик та обладнання в одержанні певних результатів [191, 192, 193, 194, 195].
Крім того, ми провели дослідження з визначення параметрів гострої токсичності на білих щурах [196, 197, 198, 199].
Експеримент передбачав проведення попереднього та основного дослідів. У попередньому досліді кожному з 16 щурів уводили всередину децис форте у формі водної суспензії в дозах 30, 50, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 і 210 мг/кг маси тіла. Контрольній тварині вводили воду. Перед введенням препарату тварин зважували. Кількість піретроїду, який вводили, визначали індивідуально, відповідно до маси тіла; при цьому об'єм, що вводився, не перевищував 2 см3.
Після аналізу даних попереднього експерименту, у зв'язку із загибеллю усіх піддослідних щурів упродовж 16 годин, був проведений основний дослід, з використанням препарату в менших дозах. За цих умов сформували 6 груп по 6 щурів у кожній. Препарат задавали в дозах 10, 15, 20, 25, 30 і 50 мг/кг маси тіла.
Далі проводили патологоанатомічні розтини тварин, що загинули в дослідах, з описом змін. У роботі був використаний макроскопічний суб'єктивний метод досліджень [200], який містив такі визначення:
- кольору органу (наявності кровонаповнення та пігментів);
- консистенції або густини органів;
- специфічних запахів;
- рисунку органу.
Патологоанатомічні зміни на розрізі визначали за наступними показниками:
- зовнішній огляд - стан видимих слизових оболонок, шкіри та її похідних (шерстяний покрив, кігті), стан підшкірних кровоносних судин;
- внутрішній огляд - проводили розтин та огляд порожнин тіла і внутрішніх органів - серця, легень, селезінки, шлунку, дванадцятипалої, тонкої, товстої кишок, печінки та нирок.
У дослідах з визначення цитотоксичності дельтаметрину використовували перещеплювану клітинну культуру нирки великої рогатої худоби МDBК, отриману з колекції клітинних культур ННЦ "ІЕКВМ". Культуру клітин вирощували на стандартних ростових середовищах Ігла і 199 (1:1) з додаванням 10 % нативної сироватки ВРХ за температури 37 0С у культуральних флаконах об'ємом 20 см3 протягом 48 годин до утворення на дні ємкості моношару клітин. Після цього вносили інсектицид у дозі 22,15 мкг/см3 з подальшими десятиразовими розведеннями (1/10 , 1/100, 1/1000 тощо). Контролем були клітини, до ростового середовища яких піретроїду не вносили.
Токсичні концентрації дельтаметрину визначали після 24 - годинної експозиції на нефіксованих культурах, під час імерсійного мікроскопічного дослідження, з використанням збільшення мікроскопа - об'єктива x 90, окуляра х 10. Цитотоксичні властивості оцінювали за цілісністю моношару та ступенем його пошкодження, характером розташування клітинних елементів, кількістю клітин із зернистою цитоплазмою.
Після визначення концентрації дельтаметрину в ростовому середовищі, яка не виявляла токсичного ефекту в клітинах, проводили дослідження впливу цих концентрацій на мітотичний режим клітин MDBK. Для цього клітини (у концентрації 80 - 100 тисяч клітин у 1,0 см3 ростового середовища) висівали на покривні скельця розміром 12 х 24 мм і розміщували у культуральних флаконах. Після 48 - годинного культивування за температури 37 оС, до моменту формування моношару, до ростового середовища вносили різні концентрації інсектициду з подальшим визначенням мітотичних параметрів клітин [201].
Клітини фіксували спиртово - оцтовим розчином (3:1) через 24, 48 і 72 годин після внесення дельтаметрину. Фарбування клітинних препаратів проводили гематоксиліном Карачі згідно з методичними рекомендаціями [202, 203].
Мітотичну активність визначали як відношення кількості клітин, які перебували на стадії мітозу, до 1000 підрахованих клітин. Характеристику патологічних форм мітозів здійснювали за класифікацією А.І. Алова [203], а їх відсоток вираховували по відношенню до загальної кількості мітозів.
За цих умов виділяли два типи патологічних мітозів, пов'язаних з:
> пошкодженням мітотичного апарату - колхіциновий (К) мітоз багатополюсний, моноцентричний та асиметричний мітози тощо;
> безпосереднім пошкодженням хромосом - хромосомні й хроматидні мости, утворення "мікроядер", хромосом що злиплися, тощо.
Мітотичну активність і процент патологічних мітозів визначали як середнє для кожної культури клітин, відповідно до загальноприйнятих розрахунків середнього арифметичного [203, 204].
Дослід щодо вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте (12,5 % к.е.) в організмі курей у гострому експерименті проводили на курах м'ясо-яєчного напрямку породи білий