Розділ 2. Об’єкти, моделі та методи дослідження
2.1. Об’єкти дослідження.
В дисертаційній роботі в якості модельних сполук, що стали за об’єкти
дослідження, були використані та досліджені 44 таких природних та синтетичних
сполук:
фенольні сполуки: б-токоферол (вітамін Е); одноядерні феноли - м-нітро-фенол;
фенол; 2,6-дитретбутил-фенол; 2,6-дитрет-бутил-4-метилфенол (іонол; дибунол);
двоядерні феноли – гідроксинафталини: б-нафтол, в-нафтол,
1,5-дигідроксинафталин;
N-вмісні гетероцикли, зокрема піридини, піримідини та пурини, а саме:
- синтетичні похідні піридинкарбонових кислот, такі як лікарський препарат
Амізон (1-метил-4-(N-бензил)-амінокарбонілпіридин - сполука РV-1, хлоргідрат
бензиламіду ізонікотинової кислоти - сполука РV-2, хлоргідрат метилового ефіру
О-ізонікотиноїлсаліцилової кислоти - сполука РV-3, хлоргідрат
(2-метоксифеніл)аміду ізонікотинової кислоти - сполука РV-4, хлоргідрат
метилового ефіру О-нікотиноїл-саліцилової кислоти - сполука РV-5;
- незаміщений 1,4-дигідропіридин та його похідні, такі як діетон, ніфедипін,
форидон та нітрепін;
- N-вмісні гетероцикли природного походження, а саме похідні пуринів та
піримідинів: біомолекули вітамінної та коферментної дії (тіамін, рибофлавін,
піридоксин, нікотинова кислота, фолієва кислота, кофеїн);
- похідні S-заміщених хіназолінів із лабораторним шифром NKC та NC.
2.2. Визначення антирадикальної активності.
Антирадикальні активності визначались за взаємодією ФАС із стабільним радикалом
2,2-дифеніл-1-пікрилгідразином (ДФПГ; DFPG) [61].
Стабільний радикал ДФПГ являє собою інтенсивно забарвлену речовину, що має
максимум поглинання у видимій області спектру (лmax = 520 нм). Взаємодія
досліджуваних ФАС, що мають у структурі молекули рухливі атоми водню, з ДФПГ,
призводить до зміни (зниження) оптичної густини ДФПГ при 520 нм; кількісна
оцінка швидкості процесу є мірою антирадикальної активності речовин, що
вивчаються.
Реакцію ДФПГ з ФАС, що вивчалися, проводили у спиртових розчинах. Застосовували
еквімолярні концентрації ДФПГ та ФАС – звичайно в концентраціях (0,25-1,0) х
(10-4-10-3) моль/л. Реакцію починали змішуванням 1 мл розчину ДФПГ та 1 мл
розчину досліджуваної речовини, і записували кінетичні криві поглинання при
контрольованій температурі інкубації (20оС - 30оС) за допомогою реєструючого
спектрофотометра (Schimadzu MPS-5000), а також визначали л520 через визначені
проміжки часу (2 хв, 10 хв, 30 хв, 60 хв, 24 год, 48 год, 72 год) за допомогою
спектрофотометру типу СФ-16, використовуючи кварцеві кювети з довжиною
оптичного шляху 1 см при температурі 20оС.
Для кількісної оцінки антирадикальної активності ФАС, що досліджувались,
розраховували такі параметри:
константа другого порядку - k2 (М-1•хв-1) швидкості зменшення концентрації
радикальної форми ДФПГ, що обчислювали за такою формулою:
k2 = Сt / Cot (Co - Сt),
де:
Co – початкова концентрація ДФПГ,
Ct – концентрація ДФПГ в момент часу t;
Т50 - час, який необхідний для зниження вихідної концентрації стабільних
радикалів ДФПГ на 50%;
ЕС50 - концентрація антиоксиданта, необхідна для зниження первинної
концентрації ДФПГ на 50%.
2.3. Визначення антиоксидантної активності.
Визначення антиоксидантної активності досліджуваних сполук проводили,
користуючись кількісним визначенням одного із продуктів перекисного окислення
поліненасичених жирних кислот мембранних фосфоліпідів (лінолевої, арахідонової,
докозогексаєнової т.і.) - малонового діальдегіду О=СН-СН2-СН=О, що може
накопичуватися в умовах ініціювання ВРО в значних концентраціях [30, 31, 94].
Досліджувалась взаємодія цієї сполуки з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) з
утворенням забарвленого триметинового комплексу з максимумом поглинання при 532
нм [2]. Реакції ВРО стимулювалися шляхом активації ферментативного
(НАДФН-залежного) та неферментативного (аскорбат-залежного) ліпопереокислення.
Реакційна суміш (1,0 мл) містила: 50 мМ трис-НCl, рН 7,4; 0,2 мМ Fe2SO4; 0,2 мМ
Na4P2O7 ;
ферментативна система: додатково додавали 1мМ НАДФН;
неферментативна система: замість НАДФН додавали 0,8 мМ аскорбату.
В кожен з варіантів середовища інкубації додавали досліджувані ФАС (звичайно в
концентраціях 10-4 – 10-3 М). Реакція починається внесенням 1-2 мг білку
біопроби (гомогенату печінки, мікросом, мітохондрій т.і.); тривалість інкубації
– 20 хв при 37оС. Після зупинки процесу внесенням в пробу 1,0 мл суміші 10%
трихлороцтової кислоти (ТХУ) з 10–2 М ЕДТА (для осадження білку та хелатування
іонів двовалентного заліза – активаторів ПОЛ) в надосадовій рідині визначали
вміст МДА реакцією з ТБК.
АОА обчислюють за формулою:
де:
Сх - концентрація МДА в контрольних пробах;
Со - концентрація МДА в досліджувальних пробах.
2.4. Вивчення АО та цитопротекторних властивостей ФАС in vivo.
Оцінку антиоксидантних та цитопротекторних властивостей ФАС in vivo здійснювали
на моделі гострого тетрахлорметанового гепатіту. Експерименти проводилися
згідно з методичних рекомендацій по доклінічному дослідженню лікарських засобів
[66]. Експерименти проводили на білих щурах-самцях лінії Вістар 3-місячного
віку, виращених у розплідниках віварію ІФТ АМН України з масою тіла 150 г - 200
г. Робота з тваринами проводилася згідно з міжнародними вимогами про гуманне
ставлення до тварин. У період експерименту тварини знаходилися у віварії при
температурі 19-240С, вологості не більше 50% , природному світловому режимі
„день–нічь”, у пластикових клітках та утримувалися в стандартних умовах
харчового та водного режимів. Тетрахлорметан у формі 50% олійного розчину
ввводили одноразово внутрішньоочеревинно у дозі 1 LD50 (1,75 мл/кг маси тіла).
Дослідження проводили за 24
- Київ+380960830922