2
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
Список сокращений......................................................6
1. ВВЕДЕНИЕ............................................................8
1.1. Актуальность темы.................................................8
1.2. Цель и задачи исследования........................................9
1.3. Научная новизна работы...........................................10
1.4. Практическая значимость результатов исследований.................10
1.5. Основные положения, выносимые на защиту..........................11
1.7. Личный вклад соискателя..........................................11
1.8. Структура и объём диссертации....................................12
1.9. Благодарности....................................................12
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................ 13
2.1. История открытия болезни, этиология и мировое распространение РРСС.................................................................13
2.2. Таксономия, физико-химическая и молекулярно-генетическая характеристика вируса РРСС...........................................16
2.3. Культивирование вируса РРСС in vitro.............................18
2.4. Репликация, вирусные белки и патогенез болезни...................19
2.5. Биологическая и генетическая вариабельность вируса РРСС..........21
2.6. Средства и методы лабораторной диагностики РРСС..................23
2.6.1. Прямое обнаружение вирусных антигенов в тканях и орг анах заражённых животных..................................................23
2.6.2. Изоляция и идентификация вируса РРСС...........................23
2.6.3. Методы обнаружения вирусного генома............................24
2.6.4. Характеристика и диагностическая ценность методов обнаружения вирусспецифических антител...........................................25
2.6.4.1. Иммуно-гистохимические методы анализа........................26
2.6.4.2. Методы твёрдофазного иммуиоферментного анализа (ELISA).......26
2.6.4.3. Реакция нейтрализации........................................27
2.6.4.4. Специфические иммуноглобулины М и диагностическая ценность их обнаружения..........................................................28
2.6.4.5. Интерпретация результатов серологических исследований........30
3
Заключение по обзору литературы........................................32
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................34
3.1. Материалы.........................................................34
3.1.1. Штаммы и изоляты вируса РРСС....................................34
3.1.2. Животные........................................................34
3.1.3. Культуры клеток.................................................35
3.1.4. Питательные среды и добавки к ним...............................35
3.1.5. Специфические иммунные сыворотки................................35
3.1.6. Моноклональные антитела.........................................36
3.1.7. Белки и ферменты................................................36
3.1.8. Матрицы для гель-фильтрации.....................................36
3.1.9. Кислоты, основания, соли........................................36
3.1.10. Растворители...................................................36
3.1.11. Красители и хромогенные субстраты..............................36
3.1.12. Детергенты.....................................................36
3.1.13. Реактивы.......................................................36
3.1.14. Исходные водные растворы.......................................37
3.1.15. Диагностические препараты......................................38
3.1.16. Оборудование...................................................38
3.2. Методы.........................................................39
3.2.1. Получение альвеолярных макрофагов свиньи........................39
3.2.2. Выделение вируса РРСС из проб органов заражённых свиней 40
3.2.2.1. Подготовка проб...............................................40
3.2.2.2. Инокуляция исследуемым материалом культур клеток, идентификация вируса..................................................40
3.2.2.3. Титрование вируса РРСС........................................41
3.2.2.4. Биопроба......................................................41
3.2.3. Определение концентрации белка..................................42
3.2.4. Приготовление конъюгатов........................................42
3.2.5. Серологические реакции, иммуногистохимические методы............43
3.2.5.1. Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ)...................43
3.2.5.2. Гистохимический вариант ИФА (ГХ-ИФА)..........................43
12
1.8. Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 134 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Список литературы включает 209 источников, в том числе 39 отечественных и 170 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 15 таблицами.
1.9. Благодарности
Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н., заведующему лаборатории Иммунологии Новикову Борису Валентиновичу; к.б.н., ведущему научному сотруднику лаборатории Диагностики Балашовой Елене Алексеевне; к.б.н., ведущему научному сотруднику лаборатории Диагностики Новиковой Марине Борисовне; лаборантам лаборатории Диагностики Макарычевой Елене Валерьевне и Малышковой Любовь Петровне за помощь при выполнении диссертационной работы. Автор выражает особую благодарность Бунькову Алексею Васильевичу за его терпение и поддержку.
Работа выполнена в лаборатории Диагностики в период с 2003 по 2007 гг. по плановым тематикам ВНИИВВиМ при выполнении Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации (шифр 01.).
13
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. История открытия болезни, этиология и мировое распространение РРСС
В 1987 году в США появились сообщения о «таинственной болезни свиней» - острой репродуктивной патологии, характеризующейся массовыми абортами на поздней стадии супоросности, снижением общего количества жизнеспособных поросят в результате рождения мертвых и слабых поросят, нарушением полового цикла у свиноматок, снижением либидо у хряков, а также высоким уровнем смертности из-за респираторных нарушений у поросят в группах доращивания (37, 69, 111, 144). Через 4 года после появления первого сообщения признаки болезни были обнаружены у свиней от 60 до 80% ферм страны (209).
В конце 80-х - начале 90-х годов прошлого столетия эпизоотии болезни со сходными клиническими признаками были зарегистрированы в Канаде (81), Японии (175), Германии (127), Нидерландах, Испании, Франции и Великобритании (192, 196, 144), Дании (62), и начиная с 1992 г. - в остальных регионах мира с развитым промышленным свиноводством (145). Болезнь имела все признаки, присущие инфекции, и ее распространение было связано с перемещением животных при коммерческих сделках и племенной работой, а также через транспортные средства, аэрогенно, и другими путями (79, 81).
Болезнь стали называть "синее ухо" (у некоторых пораженных свинок и свиноматок во время переболевания отмечали синюшность в области шеи и живота, а также ушей), "синдром бесплодия и абортов свиней", "эпидемический аборт и респираторный синдром свиней" и "таинственная болезнь свиней" (79, 81,93,98, 100, 190, 196).
Хотя эпизоотологические данные даже первых случаев болезни позволяли предположить ее инфекционную природу, вирус как этиологический агент был окончательно идентифицирован только через несколько лет (78, 192). Первый шаг в установлении вирусной этиологии возбудителя РРСС был сделан в 1990 г. Collins и др., которые воспроизвели респираторную форму болезни, за-
- Киев+380960830922