ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальные животные и препараты
В качестве основного объекта наблюдений были взяты крысы. Экспериментальные исследования были проведены на 202 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой от 180 до 250 г на модели острого экспериментального панкреатита (ОЭП; таблица 2.1). Крысам был обеспечен свободный доступ к пище и воде, их содержали в стандартных условиях с естественной 12-часовой сменой света и темноты.
Работу с лабораторными животными проводили с соблюдением правил, предусмотренных в 1985 г. Советом международных медицинских организаций и изложенных в "Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с экспериментальными животными", и замечаний, изложенных в "Письме комиссии по проблеме этики отношения к животным". В дополнение к этому, соблюдали правила, предусмотренные Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов.
С целью приручения животных и отсутствия у них стрессовой реакции в ответ на взятие их корнцангом, крыс перед началом эксперимента держали в руках по 2-3 мин в течение 5 дней, что облегчало последующие экспериментальные исследования с животными (Я.Буреш и др., 1991).
ОЭП моделировали у крыс путем однократного сдавления поджелудочной железы, доступ к которой обеспечивался при лапаротомии брюшной полости (Сыновец А.С. и соавт., 1971). Согласно данным ряда авторов, к 3-м суткам после указанного воздействия у 95% животных отмечалась морфологическая картина, соответствующая ОЭП (Вансович В.Е., 1992; Кадочников В.С., 1997; Демидов В.М. и соавт., 1999; Hughes C.B.. et al., 1995). В этот временной интервал отмечается максимально выраженные биохимические и нейрогуморальные изменения в условиях применяемой нами экспериментальной модели (Демидов В.М. и соавт., 2000; Сыновец О.А. и соавт., 1999; Grewal H.P. et al., 1994; Hughes C.B.. et al., 1995).
Выведение животных из опыта для последующих биохимических исследований производили декапитацией после введения этаминала натрия (85 мг/кг) на 3-й день с момента индукции ОЭП.
В работе тестировали эффекты сандостатина, даларгина, новой формы липосом (Запорожан В.М. и соавт., 1998; Патент України №28868) и липосомальных форм нейропептидов (Запорожан В.М. и соавт., 1998; Патент України №30214). Все вещества вводили в одинаковых дозах (50 мкг/кг, внутрибрюшинно) ежедневно, в течение 3 дней.
Сандостатин - синтетический октапептид, производное соматостатина. Даларгин - гексапептид - тирозил-2-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин. Липосомы готовили путем обработки ультразвуком смеси лецитина, фосфатилсерина, холестерина в водной среде, в атмосфере гелия. При этом смешивали токоферол, лецитин, фосфатилсерин и холестерин в мольном соотношении, соответственно: 0.06 : 1.0 : 0.18 : 1.2, причем, вместе с гелием применяют неон в соотношении 85:15% и воды не более 1 ppm, а кислорода не больше 3 ppm с возможностью получения стабильных липосом, которые разрушаются через 10-12 дней после их получения не более, чем на 10%. Липосомальные формы нейропептидов готовили таким образом: обрабатывали смесь лецитина, фосфатилсерина, холестерина ультразвуком в водной среде, в атмосфере гелия и неона; в водную среду дополнительно вводили раствор аналогов нейропептидов при общем соотношении компонентов в смеси 1:2:1 в соотношении гелия и неона 85:15%, при этом применяют ультразвук частотой 20-22 кГц, а обработку проводят при полном отсутствии кислорода.
Эксперименты выполняли в следующих группах животных (Табл. 2.1):
1 серия. Определение исследуемых показателей в сыворотке крови/паренхиме ПЖ/паренхиме печени интактных крыс (n=14).
Таблица 2.1.
Основные серии экспериментальных исследований и количество животных, задействованных в выполнении исследований.
Серии экспериментовКол-во животных1. Исследование по выбору адекватной модели острого панкреатита652. Контрольная группа крыс (ложнооперированные)14 3. Крысы с ОЭП без лечения 214. Исследование выживаемости животных с ОЭП под влиянием исследуемых препаратов325. Радиологические исследования 156. Исследования влияния даларгина на изучаемые показатели147. Исследования влияния сандостатина на изучаемые показатели118. Исследования влияния липосом на изучаемые показатели99. Исследования влияния липосомального даларгина на изучаемые показатели1010. Исследования влияния липосомального сандостатина на изучаемые показатели11ИТОГО:202
2 серия. Определение исследуемых показателей в сыворотке крови/паренхиме ПЖ/паренхиме печени с ОЭП без последующей фармакологической коррекции (n=21).
3 серия. Определение исследуемых показателей в сыворотке крови/паренхиме ПЖ/паренхиме печени крыс с ОЭП с последующим введением липосом (50 мкг/кг, в/бр) (n=9).
4 серия. Определение исследуемых показателей в сыворотке крови/паренхиме ПЖ/паренхиме печени крыс с ОЭП с последующим введением сандостатина (50 мкг/кг, внутрибрюшинно) (n=11).
5 серия. Определение исследуемых показателей в сыворотке крови/паренхиме ПЖ/паренхиме печени крыс с ОЭП с последующим введением липосомального сандостатина (50 мкг/кг, в/бр) (n=11).
6 серия. Определение исследуемых показателей в сыворотке крови/паренхиме ПЖ/паренхиме печени крыс с ОЭП с последующим введением даларгина (50 мкг/кг, внутрибрюшинно) (n=14).
7 серия. Определение исследуемых показателей в сыворотке крови/паренхиме ПЖ/паренхиме печени крыс с ОЭП с последующим введением липосомального даларгина (50 мкг/кг, в/бр) (n=10).
Методологически работа построена следующим образом: исследовавшиеся препараты тестировались в следующих группах наблюдений:
* радиологические исследования с применением меченых по I131 липосомальных и нелипосомальных форми даларгина и сандостатина;
* исследование особенностей функциональной активности системы протеолиза крови у крыс с ОЭП и влияние на эти показатели липосомальных и нелипосомальных форми далар
- Київ+380960830922