РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Клінічні методи дослідження.
Відповідно до мети і задач роботи обстежено 90 хворих на ХПн без порушення функції нирок, які отримували базову терапію та 20 здорових осіб. 45 пацієнтам, досліджуваної вибірки, на фоні базової терапії додатково призначався флуренізид. Початковими етапами дослідження було вияснення анамнезу, проведення об'єктивного обстеження органів і систем з визначенням загального та біохімічного аналізу крові, загального аналізу сечі. Крім цього, визначали добову протеінурію, ступінь лейкоцитурії за Нечипоренком, досліджували функціональний стан нирок (проба Зимницького, кліренс ендогенного креатиніну за Ребергом-Тареєвим). Використовували бактеріологічне дослідження сечі і визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків. Фізико-хімічні і бактеріологічні властивості сечі визначали за допомогою загальноприйнятих методів. Для мікробіологічного дослідження брали 3-5 мл середньої порції сечі в стерильний посуд з дотриманням умов асептики і антисептики. Визначення бактеріурії проводили методом секторальних посівів, які здійснювали на поживних середовищах. Про бактеріурію свідчила наявність 105 і більше мікробних клітин в 1 мл сечі. Мікробіологічні методи дослідження сечі, які спрямовані на виділення збудника пієлонефриту і на кількісне визначення ступеня бактеріурії, проводили при поступленні пацієнтів з ХПн на стаціонарне лікування до початку антибактеріальної терапії та при виписці.
У крові визначали концентрацію гемоглобіну, кількість еритроцитів, лейкоцитів із лейкограмою, ШОЕ і гематокрит; у біохімічному аналізі - загальний білок, креатинін, сечовину і білірубін, трансамінази, сіалові кислоти, СРП, К, Na, Ca [259]. Клінічні і біохімічні аналізи проводили при поступленні хворих у стаціонар, у динаміці лікування і перед випискою.
При ультразвуковому скануванні нирок визначали їх положення, розміри (довжина, ширина, товщина), стан мисково-лоханкової системи, паренхіми, паранефральної клітковини. [94, 181]. Всім хворим виконували оглядову рентгенографію, спрямовану на виявлення асиметрії величини і контрастності нирок, рубцевої деформації, наявності кальцифікатів і т. д. Застосовували радіонуклідне дослідження, яке дозволяло встановити порушення та асиметрію функції нирок, особливо екскреторного сегменту.
Комплекс лабораторних досліджень додатково включав обстеження сироватки крові на наявність специфічних антихламідійних імуноглобулінів G та М, визначення імунологічного статусу та рівня ЕІ. З метою дослідження використовували кров.
2.2. Виявлення хламідійного агента.
Для проведення обстеження сироватки крові на наявність специфічних антихламідійних імуноглобулінів G та М використовували метод непрямого імуноферментного аналізу на мікропланшеті. Використовували імуноферментний аналізатор "Statfax-303". Титр Ig G виявляли за допомогою реактивів BioRAD "PLATELIA Chlamydia Ig G" (Франція). Вміст Ig М у EU/ml (умовних одиницях на мл) виявляли за допомогою реактивів Fim Biologische Analysensystem G mbH "Bag-Ghl.-EIA-M" (Німеччина). Розводили зразки крові у співвідношенні 1:20. Вносили розведені зразки по 200 мкл в кожну мікролунку, інкубували протягом 1 год при 37 ?С після чого промивали 3 рази. Потім вносили по 200 мкл кон'югату, проінкубувавши протягом 1 год при 37 ?С, промивали 4 рази. Додавали 200 мкл субстрату і інкубували 30 хв при кімнатній температурі. Після цього додали 100 мкл зупиняючого розчину і проводили спектрофотометрію при довжині хвилі 492-620 нм.
2.3. Методика дослідження параметрів імунної реактивності організму.
Для визначення імунного статусу організму ми використовували реакцію непрямої поверхневої імунофлюоресценції [118, 369] з допомогою мишачих моноклональних антитіл - МКА LT фірми "Сорбент" (Московський інститут імунології).
Мишині моноклональні антитіла LT3 проти антигену СDЗ Т-клітин периферичної крові використовуються для виявлення загальної популяції Т-лімфоцитів. За допомогою МКА LT4 діагностували антиген СD4, який присутній на субпопуляції Т-клітин із хелперною функцією. Мишині МКА LT8 виявляють антиген СD8, присутній на субпопуляції Т-клітин із супресорною функцією. МКА 3F3 реагує з антигеном СD22, який експресоваий на клітинній поверхні В-лімфоцитів і служить для їх виявлення, а МКА LNK16 - з СD16 (експресовані на натуральних кіллерах).
Лімфоцити виділяли із гепаринізованої крові шляхом центрифугування на градієнті Фіколл-Верографіну (щільністю 1,077 г/мл). Пізніше 1-0,1 млн лімфоцитів в об'ємі 50 мкл вносили в центрифужні пробірки. До клітин додавали 5 мкл моноклональних антитіл і інкубували 30-45 хв при плюс 4 °С. Після чого додавали 150 мкл розчину Хенкса і центрифугували 5 хв при 200g. Після вилучення супернатанта знову вносили 50 мкл розчину Хенкса. Клітини суспендували і після додавання 150 мкл розчину Хенкса центрифугували 5 хв при 200g. Попередньо вилучивши супернатант, до осаду додавали 50 мкл F(ab')2-фрагментів овечих антитіл до Ig миші, мічених ФІТЦ і розведених 1:100. Для розведення використовували фізрозчин, забуферений фосфатами (PBS) або розчин Хенкса. Знову клітини суспендували і інкубували 30 хв при плюс 4 °С. Після серії чергових відмивань розчином Хенкса клітини спостерігали під флуоресцентним мікроскопом. При спостереженні в затемненому приміщенні використовували об'єктив ?90 та окуляр ?3. Кількість антиген позитивних клітин визначали як процент флуоресцуючих клітин при огляді 200 лімфоцитів з відрахунком процента флуоресцуючих клітин, які спостерігались в препараті від'ємного контролю. В якості від'ємного контролю використовували препарати, які були підготовлені аналогічним чином за винятком того, що замість моноклональних антитіл клітини обробляли розчином Хенкса або нормальними Ig миші.
За результатами підрахунку кількості CD4+, CD8+ вираховували індекс диференціювання (ІД) лімфоцитів: спiввiдношення CD4+ до CD8+.
Коефiцiєнт iмуностимулюючої дiї флуренізиду [9] визначали за формулою:
КIД = (Тл2/Тл1)/(Тлб