Розділ 2
Загальна методика та основні методи досліджень
Метою досліджень, проведених при виконанні дисертаційної роботи, було
поглиблення біохімічних і молекулярно-біологічних основ патогенезу лейкозу ВРХ.
У завдання роботи входило:
1) дослідження метаболічного, мінерального і вуглеводного профілю в крові у
інфікованої вірусом лейкозу ВРХ;
2) розробка методу виявлення впливу вірусу лейкозу великої рогатої худоби на
геном лейкоцитів;
3) дослідження окремих ділянок геному лейкоцитів інфікованої вірусом лейкозу
великої рогатої худоби;
4) дослідження окремих локусів ДНК за RAPD-спектром у інфікованої вірусом
лейкозу великої рогатої худоби.
Дослідження проведені в ТЗОВ "Україна" Тернопільського району Тернопільської
області, неблагополучному по лейкозу ВРХ, у 1998–2000 рр. Господарство
спеціалізується по вирощуванню великої рогатої худоби чорно-рябої породи,
м’ясо-молочного напрямку. Утримання тварин прив’язне у стаціонарних
приміщеннях, а в літній період – стійлове з використанням пасовищ.
Дослідження були проведені в два етапи: на початку та в кінці стійлового
періоду (у листопаді і квітні відповідно). З метою формування контрольної і
дослідної груп, кров від ВРХ досліджували в РІД для виявлення тварин позитивно
та негативно реагуючих на лейкоз. На основі отриманих результатів РІД були
сформовані контрольна та дослідна групи ВРХ, по 10 голів у кожній. Піддослідні
тварини обох груп утримувались в окремих приміщеннях і отримували однаковий
раціон. У тварин контрольної і дослідної груп ВРХ досліджували температуру
тіла, частоту пульсу, дихання, стан лімфатичних вузлів.
Молекулярно-генетичні дослідження (ПЛР та RAPD-PCR) проводилися в лабораторії
генетики Інституту свинарства УААН (м. Полтава). Для дослідження
довільних ділянок геному ВРХ застосували метод RAPD-PCR з праймером, який
охоплює декілька локусів геному ВРХ та ПЛР метод на локуси МАF-50 та ВМ-315.
Структури праймерів для RAPD-PCR та локусів МАF-50 та ВМ-315 синтезували в НВП
"Біоаналітичні технології", м. Харків.
Біохімічні дослідження проводились у хіміко-токсикологічному відділі
Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Мінагрополітики
України.
* Реакцію імунодифузії проводили згідно "Наставления по применению наборов для
серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота", затвердженого
Департаментом ветеринарії Міністерства сільського господарства і продовольства
РФ 03.02.1997 р.;
* Генетичні дослідження проводили згідно "Методичних рекомендацій по
організації та проведенню робіт у лабораторіях, які використовують метод
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)" від 09.01.2002 р.; № 15-14/1 та
"Методичних вказівок по оцінці дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на
геном соматичних клітин тварин методом полімеразної ланцюгової реакції з
довільними праймерами (RAPD-PCR)" від 10.07.2001 р.; №15-14/204;
* Вміст мікроелементів (міді, цинку, марганцю, кобальту, заліза) в кормах і
крові тварин проводили методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії на приладі
AAS-30 (Carl Zeiss Jena, Німеччина);
* Вміст загального білка в сироватці крові проводили рефрактометричним методом
згідно "Методичних вказівок щодо методів біохімічних досліджень біологічного
матеріалу, які застосовуються в державних лабораторіях ветеринарної медицини
при діагностиці захворювань неінфекційної патології від 03.07.2000 р.;
№15-14/29;
* Визначення вмісту окремих білкових фракцій в сироватці крові проводили
нефелометричним методом згідно "Методичних вказівок щодо методів біохімічних
досліджень біологічного матеріалу, які застосовуються в державних лабораторіях
ветеринарної медицини при діагностиці захворювань неінфекційної патології від
03.07.2000 р.; №15-14/29;
* Вміст глюкози в крові визначали за методом Сомоджі, вміст вітаміну А в
сироватці крові – колориметричним методом згідно "Методичних вказівок щодо
методів біохімічних досліджень біологічного матеріалу, які застосовуються в
державних лабораторіях ветеринарної медицини при діагностиці захворювань
неінфекційної патології від 03.07.2000 р.; №15-14/29;
* Статистичну обробку результатів досліджень проводили з допомогою
комп’ютерного програмного забезпечення Microsoft Excel-2000.
При дослідженні впливу вірусу лейкозу на структуру геному ВРХ проводили
ДНК-типування клітин крові тварин, що включало визначення алелів окремих
мікросателітних локусів та отримання RAPD-спектрів в полімеразній ланцюговій
реакції ПЛР.
При постановці ПЛР дотримувались загальних правил, викладених у "Методичних
рекомендаціях по організації та проведенню робіт у лабораторіях, які
використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)" від 09.01.2002 р.;
№ 15-14/1 [225]. У роботі додержувались вимог по організації робіт та правила
планування приміщень лабораторії ПЛР-діагностики
Загальні правила:
* Обробка клінічного матеріалу – у ламінарних шафах або настільних боксах з
УФ-лампами.
* Реагенти та клінічний матеріал зберігались окремо.
* Робоче місце було забезпечено індивідуальним набором реагентів та
автоматичних піпеток.
* Різні етапи роботи при ПЛ-аналізі проводили у окремих приміщеннях:
– кімнаті обробки клінічного матеріалу;
– кімнаті власно ПЛР;
– кімнаті детекції продуктів ПЛР.
У кожному приміщенні був маркований набір лабораторного обладнання,
УФ-освітлювачів, автоматичних піпеток, посуду, реагентів, халатів, шапочок і
рукавичок, а також окремий набір інвентару для прибирання кімнати.
* З метою недопущення перенесення ампліконів повітрям із кімнати детекціі
продуктів ПЛР до ПЛР-приміщення їх розташовували якомога далі одна від одної.
Робота була організована в одному нампря
- Київ+380960830922