РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ, ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Експериментальна частина
В експерименті було використано 30 білих щурів лінії Wistar, які знаходились на утриманні віварію УМСА протягом 45 діб. Всі тварини мали документ про підтвердження чистоти лінії. Були сформовані наступні групи:
1. Інтактна - 6 тварин, яким не моделювали гнійну рану.
2. Контрольна - 12 тварин, яким моделювали гнійну рану та проводили традиційне лікування, на фоні якого вводили внутрішньом'язово фізіологічний розчин по 0,2 мл, терапія тривала 10 діб.
3. Дослідна - 12 тварин, яким моделювали гнійну рану та проводили традиційне лікування, на фоні якого вводили внутрішньом'язово вермілат в загальноприйнятій терапевтичній дозі 0,12 мг/кг, терапія тривала 10 діб.
Експериментальні дослідження були проведені в наступному обсязі (табл. 2.1.1).
Для відтворення гнійної раньової інфекції використовували штам патогенного стафілококу S. aureus F 49 АТСС 25923, отриманий у міській бактеріологічній лабораторії (м. Полтава), який вирощували на середовищі Чистовича з метою відновлення вірулентності еталонного музейного штаму. За стандартною методикою М.Д. Абдулаєва ?163?, 24 щурам під ефірним наркозом наносили рани загальною площею 120 мм2 і поверхню зрошували суспензією S.aureus, яка містила 1012 кл/мл фізіологічного розчину. Через добу проводили вторинне інфікування ран 1010 кл/мл стафілококу під утворений струп.
Таблиця 2.1.1
Методи досліджень та їх кількість
Методи дослідження (кількість досліджень) Групи тваринІ
інтактна
n = 6ІІ
контрольна
n = 12ІІІ
дослідна
n = 12імунологічні
(180)367272планіметричні
(240)-120120гістологічні
(48)-2424мікробіологічні
(288)-144144статистичні
(474)36219219
На другу добу у всіх тварин спостерігали ознаки гнійного запалення: рани були вкриті гнійно-некротичним ексудатом, набряк розповсюджувався на навколишні м'які тканини, площа раньового дефекту значно зростала. Також у 30% щурів інфекційний процес супроводжувався лімфаденітом шийних та здухвинних лімфовузлів (рис. 2.1.1).
Рис. 2.1.1. Білий щур лінії Wistar № 22 з модельованою раною інфікованою St. aureus F49. Друга доба експерименту.
2.1.1. Імунологічні методи досліджень.
Визначення титру гемаглютинінів в сироватці крові тварин. В основі методу була здатність аглютинінів, які виникають в сироватці крові імунізованих еритроцитами барана тварин, зв'язуватись з цими корпускулярними антигенами та утворювати характерний аглютинат - осад в вигляді "килимка" на дні планшети [222].
При позитивній реакції гемаглютинації спостерігали утворення осаду у вигляді "килимка" на дні лунки. Ознакою негативної реакції була сегментація еритроцитів у вигляді щільної напівгранули. Титр гемаглютинінів визначали як двоїчний логарифм максимального розведення сироватки, при якому ще спостерігалася позитивна реакція гемаглютинації.
Визначення кількості циркулюючих імунних комплексів. Принцип методу був оснований на нефелометрії різної розчинності мономерів імуноглобулінів у складі імунних комплексів при наявності в середовищі поліетиленгліколю (ПЕГ). Зміну густини розчину реєстрували на спектрофотометрі при довжині хвилі 280 нм.
Для визначення рівня ЦІК використовували тест-систему НПО "Реакомплекс", м. Чита ?163?. При проведенні розрахунків брали пропускання контрольної проби за 100%.
Визначення титру комплементу сироватки крові тварин. Для визначення комплементарної активності сироватки крові тварин використовували мікрометод гемолізу еритроцитів барана в гелі агарози [222]. Принцип методу був оснований на здатності продуктів активації комплементу індукувати лізис корпускулярних антигенів в комплексі антиген-антитіло. При використанні в якості антигенів еритроцитів барана та гемолітичної сироватки в якості антитіл у присутності комплементу спостерігали лізис еритроцитів. За ступенем гемолізу судили про гемолітичну активність комплементу.
Титр комплементу розраховували за формулою: Со = До х Ск / Дк,
де До - діаметр зони гемолізу дослідної сироватки, Дк - діаметр зони гемолізу стандартного комплементу, Ск - відома концентрація стандартного комплементу в мг/мл.
Метод визначення функціональної активності фагоцитів. В основі методу була здатність фагоцитів захоплювати мікробні клітини. Функціональну активність перитонеальних макрофагів щурів вивчали за стандартною методикою [222].
Визначали фагоцитарний показник у розрахунку на 100 нейтрофілів.
2.1.2. Планіметричний метод дослідження.
Планіметричним методом Попової Л.Н. ?163?, вивчали швидкість загоєння рани і зміну її розмірів. На рану накладали шматок стерильного целофану і на ньому чорнилами обмальовували її контур. Потім целофан з нанесеним контуром накладали на міліметровий папір і шляхом підрахунку квадратних міліметрів в середині контуру визначали площу рани.
При повторному дослідженні таким же чином визначали площу рани, встановлювали процент зменшення її за добу по відношенні до площ при попередньому вимірюванні за наступною формулою:
((S-Sn) / t) x 100%
де Sn - площа рани при попередньому вимірюванні, S - площа рани при даному вимірюванні, t - число днів між вимірюваннями.
2.1.3. Гістологічний метод дослідження
Методика фіксації тканин формаліном та виготовлення гістологічних препаратів. Принцип методу фіксації полягає у тому, що фіксатор швидко проникав в тканини, здійснював тривалу фіксуючу дію, зберігав форму, забарвлення і структуру об'єкта, який досліджували. Принцип методу проводки полягав у тому, що в результаті проводки гістологічних препаратів тканини звільнялись від надлишків фіксатору, зневоднювались, насичувались і заливались парафіном. Гістологічні препарати робили за стандартною методико