РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Схема досліджень
Для виконання поставлених завдань було проведено дві серії дослідів. Метою
першої серії дослідів було дослідження впливу стресу-відлучення поросят від
свиноматки на інтенсивність ПОЛ та активність ферментативної і неферментативної
САЗ в їх організмі та з'ясування впливу підвищеного рівня вітамінів А і Е та
селену в організмі поросят при відлученні від свиноматки шляхом парентерального
введення їм вказаних вітамінів та мікроелемента на вміст у їх крові вітамінів А
і Е, продуктів перекисного окислення ліпідів (гідропероксидів і малонового
діальдегіду) та активність ферментів антиоксидантної системи
(супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази і глутатіонредуктази). При цьому
досліджувалася кількість еритроцитів та співвідношення їх окремих різновікових
популяцій, а також вміст гемоглобіну в еритроцитах через різні строки після
відлучення та при введенні їм вітамінів А і Е та селену.
Досліди проведено на базі дослідного господарства Львівського державного
аграрного університету. Було сформовано 4 групи підсисних поросят великої білої
породи по 5-7 голів у кожній - одна контрольна і 3 дослідних. Поросятам 1-ї
дослідної групи за 3 дні до відлучення внутрішньом’язово вводили селеніт натрію
з розрахунку 0,075 мг селену на кг маси тіла (поросятам контрольної групи при
цьому вводили відповідну кількість фізіологічного розчину); поросятам 2-ї
дослідної групи – за 3 дні до відлучення внутрішньом’язово вводили селеніт
натрію у вказаній дозі разом з вітамінами А (80000 МО/мл) і Е (30 мг/мл).
Поросятам 3-ї дослідної групи за 3 дні до відлучення внутрішньом’язово вводили
вітаміниА (80000 МО/мл) і Е (30 мг/мл). Поросят до 45-денного віку утримували
під свиноматками; на 45-й день проводилось відлучення поросят від свиноматок.
Після відлучення тварини одержували комбікорм, який забезпечував їх потребу в
основних елементах живлення згідно норми.
Метою другого досліду було дослідження впливу інсуліну і кортизолу при введенні
їх поросятам протягом 3-х днів перед відлученням на активність АОС. Було
сформовано 3 групи поросят великої білої породи, по 5-7 голів у кожній. Тварини
1-ї групи правили за контроль. Поросятам 2-ї групи за 3 дні до відлучення
внутрішньом’язово вводили інсулін з розрахунку 0,15 МО/кг живої маси через
кожних 12 годин протягом 3-х днів, поросятам 3-ї групи внутрішньом’язово
вводили кортизол у дозі 40 мг/кг живої маси.
Для біохімічних досліджень використовували зразки крові, одержанні від поросят
всіх груп шляхом пункції краніальної порожнистої вени за 5 дні до відлучення,
через 1, 3, 6, 9 і 14 днів після відлучення. В якості антикоагулянту
використовували гепарин – 100 од. на 1 мл цільної крові. Для одержання плазми
кров центрифугували при 3000 обертів на протязі 10 хв. Еритроцити перед
використанням у дослідженнях промивали 0,015 М розчином NaCl, виготовленого на
5 мМ фосфатному буфері (рН – 7,4) при температурі 2-4С0 із послідуючим
осадженням їх шляхом центрифугування на протязі 10 хв при 5000 обертів. Гемоліз
еритроцитів проводили шляхом додавання їх до двох об'ємів охолодженої до +4оС
дистильованої води та двохкратного заморожування клітин крові у рідкому азоті.
Гемолізат очищали від строми та незруйнованих еритроцитів шляхом
центрифугування на протязі 5 хв при 1000 обертів.
Еритроцити фракціонували на різновікові популяції ("молоді", "зрілі", "старі")
у градієнті густини сахарози і визначали їх співвідношення. В еритроцитах
визначали активність СОД, ГП, ГР, відновленого глутатіону та гемоглобіну. У
плазмі крові - вміст гідроперекисів ліпідів та малонового діальдегіду,
адреналоподібних речовин, кортизолу, сечовини, глюкози.
Одержані цифрові дані опрацьовували статистично: визначали середньо арифметичну
величину (М), середню квадратичну помилку (m) і вірогідність різниць (р) між
досліджуваними показниками.
2.2. Визначення активності супероксиддисмутази в еритроцитах
Визначення активності супероксиддисмутази в еритроцитах поросят проводили за
методом Фрайда, в модифікації Чеварі і сп. [107]. Принцип методу полягає у
відновленні нітротетразолію супероксидними радикалами, які утворюються в
реакції між феназинметасульфатом і відновленою формою нікотинаміддинуклеотиду
(NADH). Утворення нітроформазану, продукту відновлення нітротетразолію,
блокується наявною в еритроцитах супероксиддисмутазою. При цьому еритроцити
гемолізували дистильованою водою у співвідношенні 1:9. Для усунення шкідливого
впливу гемоглобіну в гемолізат додавали 0,2 мл абсолютного спирту і 0,25 мл
хлороформу. Для швидкого розділення фаз до вказаної суміші додавали 300 мг
КН2РО4, після чого вмістиме інтенсивно перемішували і центрифугували протягом
30 хвилин при 4000 g. Далі 0,1 мл супернатанту змішували з 1,5 мл інкубаційної
суміші (37 мг ЕДТА-Nа2, 330 мг нітротетразолію синього, 55 мг
феназинметасульфату і 300 мг 0,15 М фосфатного буферу рН-7,8) і 0,05 мл розчину
НАДН у трис-ЕДТА буфері (рН 8,0) та інкубували при кімнатній температурі 30
хвилин, після чого вимірювали екстинцію при довжині хвилі л=540 нм. У
контрольній пробі замість гемолізату еритроцитів використовували дистильовану
воду. Активність ферменту визначали за формулою: Х =ДЕк.пр. - ДЕд.пр./ ДЕк.пр.
де Х – ступінь блокування утворення нітроформазану; ДЕк.пр. – екстинція
контрольної проби, од. екст.; ДЕд.пр. – екстинція дослідної проби, од. екст.
2.3. Визначення активності глутатіонпероксидази в еритроцитах
Активність глутатіонпероксидази в еритроцитах досліджуваних поросят визначали
за модифікованим методом Моіна [114]. Критерієм активності глутатіонпероксидази
є швидкість окиснен
- Київ+380960830922