РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика піддослідних тварин, токсину блідої поганки та апробованих
препаратів
Експериментальні дослідження проводились на 274 нелінійних білих щурах-самцях
масою 0,160-0,200 кг. Тварин утримували в умовах віварію на гіпонатрієвому
раціоні харчування. Для вивчення впливу аманіта-фаллоїдинового токсину на нирки
щурів попередньо було встановлено токсичність блідої поганки (екстракту гриба),
ступінь токсичності оцінювали за летальністю отруєних тварин. Досліджено
лікувальну ефективність тіотриазоліну та гістидинату міді; дію цих
фармакологічних препаратів оцінювали за смертністю та тривалістію життя
отруєних тварин. Вивчено механізм дії токсинів блідої поганки на нирки та кров,
а також проведено корекцію виявлених змін тіотриазоліном і гістидинатом міді.
Отруєння щурів здійснювали одноразовим внутрішньоочеревинним введенням
екстракту блідої поганки, отриманого за методом H.Wіeland, R. Hallermayer
[258]. Зібрану в лісах Тернопільської області бліду поганку очищали у день
збору від домішок, потім під проточною водою гриби промивали та гомогенізували
в електроподрібнювачі. До гомогенату додавали метанол у ваговому співвідношенні
1:30 (гриби:метанол), кип'ятили 30 хв, фільтрували за допомогою водоструменевої
помпи. В послідуючому метанол випаровували до отримання маслянистої краплі, яку
суспензували ізотонічним розчином хлористого натрію з таким розрахунком, щоб
доза токсину, що вводиться, містилась у 1 мл. Хроматографічним дослідженням
підтверджували відсутність метанолу в робочому розчині екстракту.
При розрахунках летальних доз виходили з сухої маси грибів. Для цього частину
грибів з кожного збору сушили до постійної маси (вміст води у грибах коливався
від 93% до 97% від сирої маси). Токсичність отрути блідої поганки визначали за
методом Кербера [9].
Корекції порушень виявлених метаболічних змін проводили за допомогою препаратів
тіотриазоліну і антиоксиданта гістидинату міді. Тіотриазолін (хімічна назва –
морфоліній 3-метил-1,2,4-триазолін-5-тіоацетат; емпірична формула
С5Н17N3O2S-C4H9NO ) виробництва фірми “Галичфарм” у вигляді 2,5 % розчину
вводили у дозі 100 мг/кг маси тіла, внутрішньом'язово, один раз на добу,
починаючи з першої доби експерименту і до кінця періоду спостережень.
Антиоксидант гістидинат міді вводили внутрішньошлунково у дозі 0,94 мг/кг
(біотична доза міді в організмі) за аналогічною для тіотриазоліну схемою.
Металокомплекс синтезовано на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної
медичної академії з гістидину та гідроксиду міді, які брали в еквімолярних
концентраціях [47,82].
Піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1-ша група - контроль; 2-га
група – уражені отрутою блідої поганки в дозі ЛД50; 3-тя група - тварини, які
після введення екстракту блідої поганки в дозі ЛД50 одержували тіотриазолін;
4-та група - тварини після введення екстракту блідої поганки в дозі ЛД50, які
одержували гістидинат міді. Контрольній групі тварин вводили відповідний обуєм
ізотонічного розчину.
Матеріалами дослідження були цільна кров, плазма крові, сироватка крові,
гомогенат нирки.
Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації їх під тіопенталовим наркозом з
наступним вилученням нирок та забором крові. Дослiдження проводили на 6, 24 та
72 год з моменту введення екстракту блідої поганки.
Експерименти на тваринах проводили у відповідності з правилами Європейської
конвенції про гуманітарне відношення до лабораторних тварин [205].
2.2. Методи визначення активності процесів вільнорадикального
окиснення та функціонального стану антиоксидантної системи
Стан пероксидного окиснення ліпідів оцінювали за вмістом дієнових кон’югатів та
малонового діальдегіду в крові та гомогенаті нирок. Стан антиоксидантної
системи оцінювали за активністю супероксиддисмутази, каталази,
глутатіопероксидази, вмістом SH-груп в крові та гомогенаті нирок,
церулоплазміну в плазмі крові. Визначали ступінь окиснювальної модифікації
білків (ОМБ) в плазмі крові та вміст метаболіту оксиду азоту в крові та
гомогенаті нирок.
2.2.1. Визначення вмісту малонового діальдегіду
Визначення вмісту малонового діальдегіду проводили за методом І.Д. Стальної,
Т.Г. Гаріашвілі [147]. Принцип методу полягає у здатності малонового
діальдегіду при взаємодії з тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі
утворювати забарвлений комплекс, інтенсивність якого адекватна вмісту МДА.
Вміст МДА визначали в плазмі і в 10 % гомогенаті нирки.
Розрахунок проводили, враховуючи коефіцієнт молярної екстинкції для МДА, який
дорівнює 1,56 Ч 105 моль-1 Ч см-1.
Вміст МДА виражали в мкмоль/л у плазмі крові та мкмоль/кг в гомогенаті нирок.
2.2.2. Визначення вмісту дієнових кон’югатів
Концентрацію дієнових кон’югатів (ДК) визначали за методом В.Б.Гаврилова,
М.І.Мішкорудної [38], який грунтується на тому, що екстраговані
гептан-ізопропіловою сумішшю гідроперекиси мають максимум поглинання при l= 232
н.
Розрахунок вмісту ДК проводили за формулами і виражали в умовних одиницях.
С= 10 Ч Е Ч V1 : V2 ум. од./ мл (для плазми)
або С= Е Ч V1 : V2 ум. од./ мл гомогенату (для нирок),
де Е - оптична щільність гептанового шару проби, V1 - кінцевий об’єм
гептанового екстракту (4 мл), V2 - об’єм досліджуваного матеріалу (2 мл).
Визначення активності супероксиддисмутази
Активність СОД визначали за відомим методом С. Чеварі [164] в модифікації O.
Дубініної [62]. Принцип методу полягає в здатності СОД конкурувати з
нітротетразолієм синім за супероксидні аніони. В результаті реакції
нітротетразолій відновлюється з утворенням гідразинтетразолію. В присутності
СОД відсоток відновлення нітро
- Київ+380960830922