рОздІл 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Лабораторні тварини і моделювання експерименту
Експериментальні дослідження проведені на 186 білих щурах-ссавцях. Усі тварини
утримувалися в стандартних умовах віварію [213] Одеського державного медичного
університету. Дослідження планувалися відповідно до основних положень
моделювання експерименту по вивченню радіаційних ефектів у щурів [214], з
урахуванням Міжнародних принципів по захисту хребетних тварин [215].
Відповідно до мети та задач досліджень, всі експериментальні тварини були
розподілених на такі групи:
І – статевозрілі щурі 3 - 3,5 міс., вагою від 180 до 200 г,
ІІ – статевонезрілі щурі 1,5 міс., вагою від 60 до 90 г,
ІІІ – старі щурі, від 12 до 13 міс., вагою від 320 до 370 г .
Кожній групі експериментальних тварин відповідав одновіковий контроль інтактних
щурів.
Експериментальних тварин опромінювали на гама-тарапевтичній установці «Агат-Р».
Тотальне г-опромінення з використанням ізотопу Со-60 проводили натщесерце в
7.30 ранку, за наступних технічних умов: разова доза 5,82 Гр, розміри поля
20х20 см, фокусна відстань (відстань від джерела до поля) 75 см, тривалість
експозиції 492 с. Під час g-опромінення тварини знаходилися в спеціально
виготовлених клітках-фіксаторах з органічного скла. Дозиметричний контроль
проводився дозиметричною службою Одеського онкологічного диспансеру, на базі
якого проводили опромінення.
Головним критерієм вибору дози опромінення було прагнення змоделювати гостру
променеву хворобу середнього ступеня тяжкості. Наявні дані в літературі
[216-218] вказують на те, що обрана нами доза, 5,82 Гр, викликає типову картину
ГПХ середнього ступеня тяжкості з 50% летальністю для щурів.
В експеримент тварин брали через 3 години та 7 діб після опромінення. Усі
дослідження проводилися за умов індукованого діурезу [219-220], з урахуванням
зазначених показників за умов спонтанного добового діурезу. Динаміка кліренсу
креатиніну та канальцевого транспорту речовин при індукованому (водному або
сольовому) діурезі дозволяли нам надати більш точнішу характеристику порушень
ниркових процесів і виявити зрушення у функціональному стані нирок опромінених
тварин.
Водне навантаження: Відстояну, підігріту до 37 0C водопровідну воду, уводили
внутрішньо-шлунково металевим зондом з розрахунку 5% від маси тіла. Відразу
після навантаження щурів помішували в спеціальні обмінні клітки, де і збирали
сечу протягом наступних 2 годин.
Осмотичне навантаження: для навантаження використовували 3% розчин хімічно
чистого хлориду натрію (осмолярність розчину складала 1050 мосмоль/кг Н2О).
Розчин хлориду натрію уводили внутрішньо-шлунково металевим зондом з розрахунку
5% від маси тіла. Сечу збирали також протягом наступних 2 годин у спеціальних
метаболічних клітках. Після збору сечі проводили евтаназію тварин шляхом
швидкої декапітації під легкою ефірною анестезією, забір крові робили в
пробірки, попередньо оброблені гепарином, зразки отриманої крові стабілізували
гепарином.
2.2. Методи досліджень
В отриманих зразках проб плазми крові і сечі проводили аналіз хімічного складу
по наступних методиках:
• загальний білок у сечі визначали фотометрично на „СФ-46” („Ломо”, виробництво
Росія) (довжина хвилі 590 нм) сульфосаліциловим методом [221];
• креатинін плазми і сечі визначали фотометрично на „СФ-46” (довжина хвилі 520
нм) по реакції з пікриновою кислотою [222].
• осмолярность сечі і плазми крові визначали загальноприйнятим кріоскопічним
методом [221] на осмометрі 3Д3 (виробництво США) .
Концентрацію нітритів у плазмі крові і сечі визначали фотометрично (довжина
хвилі 540 нм) за наступною методикою [223]. Центрифужну пробірку поміщають 0,25
моль 17% розчину фериціаниду заліза, 1 мл сечі плазми крові (води – для
холостої проби), додають 0,5 моль боратного буфера (величина рН 9,6) і 1 моль
дистильованої води;
- отриману суміш перемішують і центрифугують на протязі 20 хв при 3000 об/хв;
- відбирають 1 мл надосадової рідини в біохімічну пробірку, додають 1 мл 3%
розчину оцтової кислоти, 1 мл дистильованої води і 1 мл 4% та розчину реактиву
Гріса;
- вимір проти холостої проби проводять у кюветі з довжиною оптичного ходу 10
мм;
- калібрований графік будували за результатами фотометричного аналізу розчинів
нітриту натрію в діапазоні концентрацій від 0 до 100 мкмоль/л. Для приготування
каліброваних розчинів використовувався кристалічний розчин нітриту натрію.
Розрахункові показники функціонального стану нирок вираховували відповідно до
методів і формул [224,225]. Екскреція креатиніну із сечею розраховувалася по
формулі:
(2.1)
Еcr = Ucr ?V,
де U cr – концентрація креатиніну в сечі,
V – показник діурезу за 2 години після проведення водного або сольового
навантаження.
Аналогічним чином розраховували величини екскреції білка, осмотично активних
речовин (ОАР), нітритів. Стандартизовані величини екскреції названих речовин
визначали з урахуванням маси тіла тварини. Про швидкості клубочковоЇ фільтрації
судили по величині кліренсу креатиніну:
(2.2)
Ccr = V ? Ucr / Pcr,
де V – величина діурезу,
Ucr – концентрація креатиніну в сечі,
Pcr – концентрація креатиніну в плазмі.
Визначали фільтраційне завантаження нефронів осмотично активними речовинами,
для чого на початку визначали швидкість клубочкової фільтрації по ендогенному
креатиніну:
(2.3)
ZFP = V ? Ucr / Pcr,
Розраховували фільтраційну фракцію, або фільтраційний заряд ОАР:
(2.4)
FFosm = ZFP ? Posm,
де Posm – концентрація ОАР у плазмі крові.
Для оцінки канальцевого транспорту ОАР розраховували загальну кількість
реабсорбованих осмотично активних речовин по формулі:
(2.5)
Rosm = FFosm – Eosm,
де Eosm – екскреція ОАР, а також інтенсивність реабсорбції ( % ):
(2.6)
Rosm % = FFosm –
- Київ+380960830922