РОЗДІЛ 2
ПРОГРАМА, ОБ’ЄМ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2. 1. Морфо-функціональні методи оцінки стану репродуктивної системи білих
щурів
Експерименти по вивченню впливу несприятливих факторів навколишнього середовища
на репродуктивну функцію самців білих щурів сплановані у відповідності до
існуючих методичних рекомендацій та методичних вказівок [162-164]. При цьому
проводили макроскопічне дослідження сім`яників, яке включало зовнішній огляд з
метою виявлення патологічних відхилень, вимірювання розміру та маси обох
сім`яників, відношення маси сім`яників до маси тіла; а також визначали масу та
масові коефіцієнти придатків сім`яників та сім`яних пухирців.
Функціональний стан сперматозоїдів оцінювали за тривалістю збереження їхньої
рухливості [165], осмотичною резистентністю [166], відносною кількістю
нерухомих та патологічних форм [167].
Для мікроскопічного дослідження сім`яники фіксували в суміші Карнуа, занурювали
в парафін, готували тонкі зрізи (6-7m), забарвлювали гематоксиліном і еозином.
Препарати тонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та
мікроскопу “Олімпус”. На гістологічних препаратах підраховували ряд
морфометричних показників: індекс сперматогенезу за чотирибальною системою Fogg
and Cowing [156], кількість нормальних сперматогоній [160], відносне число
канальців зі злущеними клітинами сперматогенного ряду та 12-ю стадією мейозу
[168].
Для формування груп вагітних самиць, від яких ми планували отримати
ембріональний матеріал та потомство для подальших досліджень, в інтактних
самиць щурів масою 160-180 г вивчали функціональний стан яєчників, оцінюючи
естральний цикл методом вагінальних мазків [167]. Про наявність стійкого ритму
естрального циклу свідчила тривалість всього циклу, а також його окремих фаз,
ритмічність їх чергування і присутність всіх чотирьох стадій циклу: діеструс,
проеструс, еструс та метаеструс.
Самиць зі стійким ритмом естрального циклу на стадіях проеструс і еструс
парували з інтактними самцями за схемою 2:1. Перший день вагітності визначали
за наявністю сперматозоїдів у вагінальних мазках.
Результати оцінювали після евтаназії (шляхом дислокації шийних хребців) та
розтину половини самиць на 20-й день вагітності. При цьому визначали кількість
живих та мертвих зародків, резорбцій, місць імплантації, а також число жовтих
тіл в яєчниках. Розрахунок антенатальної загибелі ембріонів проводили за
А.М.Малашенко і І.К.Єгоровим [169], визначаючи рівень до- і постімплантаційної,
а також загальної їхньої загибелі.
Другу половину вагітних самиць залишали до природніх пологів.
З метою вивчення запліднюючої здатності самців обчислювали індекс плодючості та
індекс вагітності [164].
На протязі періоду годування спостерігали за постнатальним розвитком потомства
щурів, залишених до природніх пологів. Реєстрували розмір приплоду, число
особин різної статі, загибель щуренят після народження і приріст маси тіла в
динаміці (на 1, 4, 7, 14 і 21 дні розвитку), строки відлипання вушної раковини,
прозріння, появу первинного волосяного покриву, прорізування різців.
Розраховували відсоток виживаємості, індекси виживаємості і лактації [170]
Швидкість дозрівання сенсорно-рухових рефлексів у період годування вивчали за
тестами: з 2 дня життя “перевертання на площині”, з 5 дня життя “від’ємний
геотаксис”, з 15 дня визначали м’язову силу. Емоційно-рухову поведінку та
здатність до координації рухів досліджували з 17 дня за тестом “перевертання в
повітрі” [171].
На протязі першого місяця потомство знаходилося з самицею. По досягненні 1
місяця щуренят відлучали від самиці і розсаджували за статтю.
Двомісячних самців щурів, як і дорослих тварин, виводили з досліду в ранішні
години шляхом дислокації шийних хребців.
Матеріалом для електронномікроскопічного дослідження служили шматочки
сім’яників, аденогіпофізу та наднирників двомісячних щуренят.
Шматочки подрібненого матеріалу фіксували 2% розчином OsO4 за Caulfild [172] на
протязі 2 годин при 4oС. Шматочки аденогіпофізу попередньо фіксували на протязі
1 години глютаровим альдегідом на фосфатному буфері з наступною 2-х годинною
дофіксацією в 2% OsO4 за Millonig. Після фіксації зневоднювали в етанолі
зростаючої концентрації (до 96о при +4оС, починаючи з 96о при кімнатній
температурі), в ацетоні і заливали в суміш аралдиту та епону за
загальноприйнятою схемою [173,174]. Після попередньої ідентифікації на
світлооптичному рівні на напівтонких зрізах товщиною 1-3 мкм, забарвлених
толуїдиновим синім, різних ділянок сім’яників, аденогіпофіза і наднирників
проводили прицільне виготовлення ультратонких зрізів на ультрамікротомі
LKB-III. Ультратонкі зрізи контраcтували 2%-ним розчином оцтово-кислого
уранілацетату в 70о етанолі [175] на протязі 10 хвилин і цитратом свинцю [176]
такий же час, а потім переглядали в електронних мікроскопах ЕМВ-100БР та
ЕМ-125К.
Отриманий цифровий матеріал опрацьовували методами варіаційної статистики з
використанням критерію достовірності Ст`юдента [177] та у відповідності до
рекомендацій, викладених у посібниках [178-181].
2.2. Розробка морфометричного методу оцінки стану процесів сперматогенезу
З метою підвищення чутливості, інформативності і точності дослідження,
об’єктивності оцінки впливу несприятливих факторів оточуючого середовища на
гонади нами розроблений метод морфометричного дослідження, який дозволяє
вивчати закономірності сперматогенезу з урахуванням його різних стадій.
Суть цього підходу полягає в наступному. На поперечних зрізах звивистих
сім’яних канальців для вивчення відбираються ті з них, в яких сперматогенез
знаходиться на стадіях VIа і IXа за класифікацією C.P.
- Київ+380960830922