РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкт досліджень
Експериментальні дослідження проведені на 260 статевозрілих нелінійних білих
щурах масою 160-220 г та на 680 нелінійних білих мишах масою 18-28 г обох
статей, які були розведені у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН
України. Тварин утримували на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному
доступі до води та їжі. З метою проведення біохімічних досліджень щурів
декапітували, евтаназія інших тварин здійснювалась передозуванням ефірного
наркозу [80], згідно вимогам етичної комісії Інституту, щодо досліджень на
лабораторних тваринах.
2.2. Використані лікарські препарати і реактиви
Для дослідження були вибрані 6 протиепілептичних препаратів, які широко
використовують в клініці для лукування різних форм епілепсії: фенобарбітал (ICN
Октябрь, Росія), депакін (Sanofi, Франція), карбамазепін (ОАО Фармацевтична
фірма «Здоров’є», Україна), ламотриджин (Wellcome, Велика Британія), топірамат
(Cilag LTD, Швейцарія), фелбамат (Shering-Plough, Швейцарія).
Усі досліджувані протиепілептичні препарати вводили інтрагастрально (і/г) в
умовно-терапевтичній дозі, тобто 1/10 від ЛД50. Так, фенобарбітал
використовували в дозі 15 мг/кг для мишей та 40 мг/кг для щурів; карбамазепін –
в дозі 125 мг/кг для мишей та 200 мг/кг для щурів; депакін - 155 мг/кг для
мишей та 150 мг/кг для щурів; ламотриджин використовували в дозі 30 мг/кг для
мишей та 20 мг/кг для щурів; фелбамат – в дозі 500 мг/кг для мишей та щурів;
топірамат – 304 мг/кг для мишей та 300 мг/кг для щурів [17, 191, 261, 262].
В ході виконання роботи були використані наступні реактиви: бікукулін, коразол,
пікротоксин, тіосемікарбазид, стрихнін, каїнова кислота, езерин резерпін,
ареколін, нікотин, апоморфін - всі вказані речовини фірми “Sigma”, США;
галоперидол (“Gedeon Richter”, Угорщина), сиднокарб (“ICN Октябрь”, Росія),
етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА, “Sigma”, США), етиловий спирт
(медичний), мета бісульфат калію (чда), хлорна кислота (хч), твін-80 (“Sigma”,
США), лимонна кислота (осч), октилсульфат натрію, натрій фосфорнокислий
двозмінний (“Serva”, Німеччина).
Дистильовану воду для приготування розчинів та для введення контрольній групі
очищували (від іонів) за допомогою системи “Milli-Q”, США.
2.3. Фармакологічний аналіз нейромедіаторних механізмів дії проти- судомних
засобів
Генерація судомного розряду на рівні електрогенезу мембрани нейронів головного
мозку є результатом змін трансмембранного струму іонів натрію, кальцію, калію,
хлору [114, 176]. Ці зміни іонного струму зумовлені порушеннями синтезу,
виділення, метаболізму і рецепторної дії нейромедіаторів.
До основних нейротрансмітерних систем відносять ГАМКергічну, гліцинергічу,
глутаматергічну, холінергічну, дофамінергічну, серотонінергічну, адренергічну
системи. З огляду на те, що нейротрансмітери відіграють ключову роль в
утворенні судомних розрядів, їх поширенні і затуханні, дуже важливим є вивчення
їхньої участі в механізмі дії протисудомних препаратів [152, 162, 213].
Для визначення участі нейромедіаторних систем в механізмі дії фармакологічних
препаратів використовували селективні фармакологічні аналізатори синаптичної
передачі нервового імпульсу.
Вивчення ролі ГАМКергічної системи у протисудомних властивостях досліджуваних
ПЕП ми проводили з використанням неконкурентних блокаторів ГАМКА рецепторів –
коразолу, а також конкурентного блокатору місця зв’язування ГАМК – бікукуліну.
Всі ці конвульсанти викликали гострий напад клоніко-тонічних судом, що
пов’язане з блокадою проведення іонів хлору всередину клітини, та формування
стійкої деполяризації клітини [102].
Моделювання гострого нападу клоніко-тонічних судом проводили на мишах. В
дослідних групах вказані конвульсанти вводили через 60 хв. після введення ПЕП.
Інтенсивність оцінювали за 5-бальною шкалою. За основу були взяті наступні
критерії [65]:
0 - відсутність судомної активності;
1 – судомні здригання, стрибки;
2 - клонічні судоми тіла;
3 -виражені тоніко-клонічні судоми з падінням тварини на бік, присутня чітка
фаза тонічної екстензії (опістотонус);
4 – загибель тварини.
Враховуючи кількість тварин в кожній групі, обчислювали середній бал судомного
нападу в групах.
Ефект препаратів оцінювали за їх здатністю:
попереджувати розвитку клонічних судом,
попереджувати розвитку тонічних судом;
усувати летальність;
знижувати загальну кількість балів судомного синдрому.
Коразол, який уводили інтраперітонеально (і/п) у дозі 90 мг/кг викликав
характерні клоніко-тонічні судоми через 60-90 сек після його введення. 50 – 70%
тварин гинули на висоті тонічної екстензії. За тваринами спостерігали протягом
60 хв.
Бікукулін вводили в дозі 20 мг/кг і/п. Після введення бікукуліну у 57 - 100%
виникали тонічні судоми, які призводили до летальності.
Для зниження активності ГАМКергічної системи використовували блокатор синтезу
ГАМК – тіосемикарбазид у дозі 20 мг/кг і/п. Оскільки судоми виникали через
60-80 хв. після уведення цього конвульсанту, то досліджувані ПЕП вводили
одночасно з тіосемикарбазидом. Враховували відсоток тварин з клонічними,
тонічними судомами та летальність. Загальний термін спостереження за тваринами
тривав 2 год.
Гліцин – основний інгібіторний медіатор спинного мозку та стовбура головного
мозку. Механизм інгібіторної дії гліцину подібний до дії ГАМК. Гліцин
стабілізує потенціал спокою, підвищуючи Cl- провідність синаптичної мембрани
[137]. В дослідженнях останніх років багато уваги приділяється гліцинергічному
механізму дії протиепілептичних препаратів [96, 122, 178].
Для дослідження дії ПЕП на гліцинергічну систему використовували блокатор
гліцинових рецептор
- Київ+380960830922