ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал и методы исследования.
Под нашим наблюдением находилось 89 больных (70 мужчин и 19 женщин) с хроническим травматическим остеомиелитом (ХТО) костей голени, протекавшим на фоне дефекта мягких тканей над костной полостью и выраженным склерозом костного ложа. Воспалительный процесс локализовался в 58 случаях в проксимальной трети (65,3 %), в 19 случаях (21,3 %) - в дистальной трети, в 6 случаях (6,7 %) - в средней трети и в 6 случаях (6,7 %) наблюдалось субтотальное повреждение большеберцовой кости. Все больные находились на лечении в Луганском областном остеомиелитическом центре с января 2000 г. по декабрь 2002 г. Возраст больных колебался от 20 до 68 лет (средний возраст - 33,1+0,9 лет). Средний койко-день составил 127,8+14,2.
Больным было произведено 112 оперативных вмешательств. Послеоперационное ведение открытой раны осуществляли с учётом тяжести и фазы воспалительного процесса. Пациентам ежедневно делали перевязки с растворами антисептиков и обязательным вакуумированием раны. В 25 наблюдениях (28,1 %) раны зажили вторично, в 58 наблюдениях (65,2 %) на поверхностно гранулирующие раны применён метод свободной кожной пластики. В 5 случаях (5,6 %) из-за некроза стенок полости была произведена сегментарная резекция очага с последующим билокальным замещением образовавшегося дефекта большеберцовой кости в аппарате Илизарова. В 1 случае (1,1 %), ввиду выраженного гнойно-воспалительного процесса, была выполнена ампутация конечности.
У всех больных во время оперативных вмешательств забирали патологический материал, помещали его в транспортную среду (среда 199) и транспортировали в бактериологическую лабораторию кафедры микробиологии Луганского государственного медицинского университета. В лаборатории проводили выделение чистой культуры, используя для пересева агар Шедлера (для облигатно анаэробных бактерий) и агар Колумбия (для факультативно анаэробных бактерий).
Критерием этиологической роли возбудителей хронических травматических остеомиелитов были титры КОЕ/мл (колониеобразующих единиц), изложенные в "Дополнении к приказу Министерства здравоохранения Украины № 4" от 05 января 1996 г. Этиологически значимыми патогенами считались те, для которых титры составляли 105 КОЕ/мл и больше. В наших исследованиях титры для условно-патогенных бактерий, выделенных в монокультуре, составляли 107-108 КОЕ/мл. При смешанной инфекции титры изолированных бактерий составляли 105-107 КОЕ/мл. Бактерии, изолированные в титрах 104 и ниже расценивались как контаминационные.
Установление родовой принадлежности культур и видовую идентификацию бактерий проводили согласно приказу Министерства здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, которые применяются в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений" и "Определителя бактерий Берджи" [75].
Идентификацию бактерий рода Staphylococcus проводили с помощью диагностического набора для бактериологических лабораторий "Стафитест-16" (производства фирмы Микро-ЛА-Тест, АО "Лахема"?, Чехия).
Установление принадлежности выделенных культур к роду Streptococcus и идентификацию стрептококков проводили с помощью диагностического набора "Стрептотест-16".
Идентификацию Pseudomonas aeruginosa проводили с использованием диагностических наборов "Энтеротест 24 (стриппированный)", "Энтеротест 16 (стриппированный)".
Для культивирования анаэробных неспорообразующих бактерий использовали анаэростат, заполненный трехкомпонентной газовой смесью (азот - 80 %, водород - 10 %, углекислота - 10 %). Посев на анаэробную микрофлору делали немедленно в течение не более чем 2 ч с момента забора материала. Засев патологического материала проводили на свежеприготовленную твердую среду с кровью и одним из антибиотиков (канамицин, гентамицин); обогащенную полужидкую тиогликолевую среду; для выявления клостридий и эубактерий материал засевали в 2 пробирки с предварительно регенерированным печеночным бульоном с наполнителем под маслом, одну из пробирок после внесения материала прогревали при 80?С в течение 20 мин для выявления споровых форм. Кроме того, материал засевали в пробирку с обезжиренным молоком, средой Вильсона-Блера и на кровяной агар. Для идентификации анаэробных возбудителей на IV этапе лабораторного исследования (6-й-7-й день) использовали культуры анаэробных бактерий, выросших на твердых и полужидких накопительных средах. Идентификацию анаэробных бактерий проводили по биохимической активности с помощью диагностического набора "Анаэротест 23" производства фирмы Микро-ЛА-Тест, АО "Лахема"?, Чехия.
Пептидогликан получали из клеточной стенки Staphylococcus aureus по методу Peterson P. K. и соавт. [131]. Культуры Staphylococcus aureus выращивали в среде, которая содержала пептонный дрожжевой экстракт (0,5 % экстракт дрожжей, 1,3 ммоль К2НРО4, 1,1 ммоль глюкозы, рН=7,2-7,4) и инкубировали при 37?С на протяжении 2-4 ч. Бактерии логарифмической фазы инокулировали в 10 л вышеуказанной среды и инкубировали при 37?С на протяжении 24 ч со встряхиванием. Бактерии получали центрифугированием (5000 g, 4?С, 10 мин) и трижды отмывали холодной дистиллированной водой. Бактериальные клетки разрушали копром со стерильными стеклянными шариками диаметром 0,1 мм (фирмы Biospec Products, USA). Копер использовали на протяжении 5 циклов по 90 с каждый. После седиментации шариков супернатант собирали и шарики трижды промывали. Супернатанты после промывки центрифугировали (14000 g, 4?С, 4 мин), а потом выделяли белый верхний слой гранул, который содержал стенки бактериальных клеток. Клеточные стенки ресуспендировали в холодной дистиллированной воде и промывали. Для выявления интактных клеток бактерий использовали окраску по Граму. Клеточные стенки ресуспендировали в 2 % растворе натрия додецилсульфата и инкубировали в течение 12 ч. Материал дважды отмывали дистиллированной водой, а по