РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти, етапи та умови проведення експерименту.
Експерименти проведені на самцях безпородних білих щурів, масою 200-250г, яких утримували в індивідуальних клітках на стандартному раціоні віварію, в осінню пору року. Всього використано 180 тварин. Всі експериментальні тварини були поділені на 4 групи:
I група - інтактні тварини, які отримували плацебо і служили контролем - 45 тварин.
II група - інтактні тварини, яким вводили розчин корвітину - 45 тварин.
III група - тварини з хронічним гіперімунокомплексним процесом, яким вводили плацебо - 45 тварин.
IV група - тварини з хронічним гіперімунокомплексним процесом, яким вводили розчин корвітину - 45 тварин.
Тест-об'єктами досліджень служили тканина печінки, моноцити та ендотеліоцити аорти. В усіх групах проведені дослідження показників окисного шляху метаболізму оксиду азоту і циклічних нуклеотидів. Паралельно, в аналогічних умовах, вивчались методом електронної мікроскопії ультраструктурні зміни у тканині печінки, моноцитах і ендотеліоцитах аорти на предмет виявлення функціонально-морфологічних взаємозв'язків з наступною їх корекцією корвітином.
В даній роботі нами використана класична модель хронічного гіперімунокомплексного процесу запропонована Cochrane C., Koffer D. [199] у модифікації Willson C.B. et al [289].
Відомо, що багатократне введення в організм розчинного антигену зумовлює утворення циркулюючих імунних комплексів, які при фіксації в мікроциркуляторному руслі викликають активацію комплементу, вивільнення лізосомальних ферментів, утворення кінінів, супероксидних радикалів, вивільнення гістаміну, серотоніну, пошкодження ендотелію і агрегацію тромбоцитів з подальшим пошкодженням тканин [42, 44, 124]. Для відтворення моделі ХГІК тваринам вводили один раз на тиждень внутрівенно бичачий сироватковий альбумін (БСА), з розрахунку 100 мг на кг маси, протягом 12 тижнів. ХГІК супроводжується збільшенням рівня ЦІК у крові. За рівнем ЦІК оцінювали розвиток хвороби.
При проведенні досліджень застосовували кверцетин (корвітин для ін'єкцій), розроблений в Україні (Київська медична академія післядипломної освіти ім.П.Л.Шупика та Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця) і освоєний Борщагівським фармацевтичним заводом. Доза препарату складала 40 мг на кг маси тіла тварини, який вводили доочеревинно 1 раз на добу, курсом 10 днів. Визначення досліджуваних показників проводили на 92 день від початку введення бичачого альбуміну і на 11 день від початку введення корвітину. Контрольним групам тварин вводили плацебо. Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації з дотриманням Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986).
2.2. Методи досліджень
У гомогенатах тканин печінки, а також у моноцитах та ендотеліоцитах тварин усіх груп визначали показники системи оксиду азоту [вміст стабільних метаболітів оксиду азоту: нітрит- (NO2?) і нітрат-аніонів ( NO3?), активність Са2+-незалежної індуцибельної (iNOS ) та Са2+-залежної конститутивної (cNOS ) синтази оксиду азоту] та циклічних нуклеотидів (циклічного аденозинмонофос-фату - цАМФ і циклічного гуанозинмонофосфату - цГМФ). Проводили електронно-мікроскопічні дослідження тканин печінки, моноцитів і ендотеліоцитів.
2.2.1 Визначення циркулюючих імунних комплексів
В роботі використано метод кількісного визначення циркулюючих імунних комплексів шляхом їх осаджування поліетиленгліколем-6000 [217]. Поліетиленгліколь (ПЕГ) сприяє неспецифічній агрегації ЦІК, створюючи сприятливе для преципітації середовище. Враховуючи, що при застосуванні ПЕГ низької концентрації (2-3%) преципітують лише великі ЦІК, а при концентрації 6-8% преципітують ЦІК великих і малих розмірів, ми використали три концентрації ПЕГ: 3,5 % - для преципітації великих ЦІК, 5,25 % - для преципітації великих і середніх ЦІК, 7 % - для преципітації великих, середніх і малих ЦІК. Оптичну щільність зразків визначали на спектрофотометрі в кюветах 1х1 при довжині хвилі 450 нм. Відповідь виражали в одиницях оптичної щільності.
2.2.2. Визначення гемолітичної активності комплементу
Гемолітичну активність комплементу визначали уніфікованим методом [77] за 50 % гемолізу. Комплемент, що міститься в досліджуваному матеріалі викликає гемоліз еритроцитів барана, які сенсибілізовані гемолітичною сироваткою. Залежність між кількістю комплементу та числом лізованих еритроцитів барана має лінійний характер в інтервалі 25-75 %-го гемолізу. Тому, точне кількісне визначення гемолітичної активності комплементу повинно проводитися саме в цьому інтервалі. Гемолітична активність комплементу встановлюється по титру - найбільшому розведенні свіжої сироватки, яке забезпечує лізис 50 % еритроцитів, які містяться в 1 мл стандартизованої гемолітичної системи при 37 °С за 1 год. Активність комплементу виражається в 50 % гемолітичних одиниць СН50.
2.2.3. Підготовка тканин печінки для визначення показників системи оксиду азоту та циклічних нуклеотидів
Після декапітації тварини швидко виділяли тканину печінки і поміщали у холодний фізіологічний розчин. Потім тканину витягували з фізрозчину, просушували фільтрувальним папером і зважували на торзійній вазі. Після зважування тканину переносили в холодну керамічну ступку, в яку попередньо наливали 3 мл 5% розчину трихлороцтової кислоти (ТХОК), і швидко розтирали пестиком. Гомогенат зливали в центрифужну пробірку, перемішували скляною паличкою і центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв. Надосадову рідину зливали в 10 мл скляні пробірки. Проводили промивку супернатанту 5 мл диетилового ефіру, після чого відсмоктували аспіратором ефірний шар. Промивку здійснювали чотири рази. Відмиту ефіром від ТХОК надосадову рідину зливали в 10 мл флакони, поміщали в сушильну шафу при t=56о і висушували. Отриманий сухий залишок розчиняли в 0,5 мл трис-буфера і визначали в ньому досліджувані показники.
2.2.4. Виді