РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження фармакокінетики аміксину було проведено з використанням - радіоактивного аналога препарату 3Н-аміксину - 2,7-біс-[2-N,N-діетиламіно-[1-3H]-етоксі]-флуорен-9-он дігідрохлорид; 2,7-діоксіфлуоренон; 2-оксі-7-діетиламіноетоксі-флуоренон, які синтезовані в СП "ІнтерХім" і Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України. Методи синтезу, докази хімічної будови були викладені в роботах [134, 135].
У ході науково-дослідної роботи також використовувалися: TRITON Х-100, 2,5-діфенилоксазол (ПОПОП), 1,4-біс-2-(5-феніл) оксазолилбензол (ППО) і рідкі сцинтилляционные суміші фірми "Сanberra- Paсkard". Інші реактиви виробництва фірми "Acros" марки ч.д.а. та о.с.ч.
Досліди були проведені на нелінійних мишах масою 20 - 25 г і щурах лінії "Вістар" масою 200 - 220 г. Експериментальні тварини витримувалися на повноцінній лабораторній дієті при природному світловому циклі. Досліджувані водорозчинні сполуки вводили в ізотоничному розчині NaCl у дозі 50 мг/кг.
Вибір дози препарату грунтувався на підставі попередних досліджень його фармакодинамикі [56, 57] і є оптимальною для кількісного визначення загального радіоактивного матеріалу. Були використані внутрішньовенний, пероральний способи введення речовин експериментальним тваринам.
2.1. Методи дослідження фармакокінетики 3Н-аміксину
2.1.1. Оптимізація процесів екстракції загального радіоактивного матеріалу з біосубстратів в модельних експериментах та in vivo. Для створення оптимальних умов екстракції лікарських речовин з біологічних субстратів найчастіше використовуваються модельні досліди з наступним розрахунком метрологічних характеристик [137].
Для визначення параметрів процесу кінетики екстракції загального радіоактивного матеріалу в модельних експериментах - дослідах in vitro, брали у контрольних тварин наважки печінки і готували гомогенати у фізрозчині у співвідношенні 1:5. До 1 мл гомогенату печінки мишей додавали 3Н-аміксин у зростаючих дозах. Потім здійснювали п'ятиразову хлороформну екстракцію (5 мл хлороформу). Після поділу фаз (водна фаза - органічна фаза) пастерівською піпеткою відбирали хлороформ після кожної екстракції.
Для оптимізації процесів екстракції загального радіоактивного матеріалу та окремих метаболітів препарату з біосубстратів у дослідах in vivo проводилася рН-залежна рідин-рідинна екстракція (хлороформом). Збір екскретів у метаболичніх камерах проводили протягом 2 діб. Відбирали 1 мл сечі і препарат екстрагувався 5-ти кратно послідовно 15 мл хлороформу. Наважка калу становила 100 мг у щурів і 10 мг у мишей, розчинялася в 1 мл води і проводили екстракцію тим же об`эмом хлороформу.
Вся відібрана кількість хлороформу випарювалася, заливалася толуольним сцинтилятором та визначалася загальна радіоактивність кожної екстракції на рідинному сцинтиляційному лічильнику TRI-CARB (Canberra- Packard, USA).
2.1.2. Хроматографічний розподіл аміксину і його вільних метаболітів. Наведені методи дозволяють визначити загальний вміст радіоактивного матеріалу, суми екстрагуємих хлороформом (вільних) і водорозчинних метаболітів аміксину.
Дослідження фармакокінетики лікарського засобу неможливо без кількісного визначення вихідної сполуки та продуктів його біотрансформації. Найбільш зручним та розповсюдженим є метод хроматографування і подальше встановлення структури індивідуальних сполук фізико-хімічними методами. Поділ 3Н-аміксину і його метаболітів проводили методом зонної радіохроматографії. У цьому випадку використвувалася хроматографія в тонкому шарі на пластинах "Silufol" UF - 450. Хлороформні екстракти біосубстратів наносили у вигляді лінії 2,5 - 3 см на 3 см вище нижнього краю пластинки, загальна довжина якої становила 15 см. Для відділення коекстрактивних речовин хроматографія проводилася в чотирьоххлористому вуглеводні в напрямку до нижнього краю пластинки. У цьому випадку аміксин і його похідні залишалися на стартовій лінії, а коекстрактивні речовини (жири, воски, пігменти та ін.) мігрують. Частину пластинки на 1 см нижче стартової лінії відрізають і хроматографують у більш полярній системі розчинників толуол : триетиламін : метанол (10:1:0,7) - для екстрактів екскретів щурів і толуол : хлороформ : триетиламін : метанол (5:5:3:1,5) - для екстрактів екскретів мишей. Кількісне визначення радіоактивності здійснювалося в толуол-спиртовому сцинтиляторі на рідинному сцинтиляційному лічильнику.
Ідентифікація 3Н-аміксину і його метаболітів здійснювалася за значеннями Rf при опроміненні хроматограм УФ - світлом (прилад "Хроматоскоп - 254") з використанням синтезованих передбачуваних метаболітів.
2.1.3. Метод визначення загального радіоактивного матеріалу в організмі експериментальних тварин.
2.2. Вивчення процесів розподілу в організмі мишей
Для проведення експерименту з вивчення процесів розподілу аміксину використано 100 нелінійних мишей, вагою 20 - 22 г. Аміксин (в ізотонічному розчині) вводили внутришньовенно (у хвостову вену) і перорально у дозі 50 мг/кг. Через 5, 15, 30 хв та 1, 2, 4, 8 та 24 год тварин декапитували і брали зразки органів і тканин для визначення вмісту 3Н-матеріалу в плазмі крові та інших органах.
Зразки крові поміщали в центрифужні пробірки, обмиті розчином антикоагулянту - гепаріну (500 IU/ml). Кров центрифугували протягом 10 хв при 2000 g і весь відібраний об?єм супернатанта (плазма) поміщали в сцинтиляційні флакони.
У експериментальних тварин брали наважки органів - мозок, печінка, селезінка, нирки, серце, кістяковий м'яз, легеня й готували гомогенати у фізрозчині в співвідношенні 1:5.
Для визначення загальної радіоактивності у вимірювальні флакони відбирали 0,3 мл гомогенату вище зазначених органів і додавали 15 мл толуол-спиртової сцинтиляційної рідини. Визначення радіоактивності проводили на сцинтиляційному лічильнику "Сanberra- Paсkard TRI-CARB 2700 TR" (США).
2.3. Вивчення процесів виведення аміксину з організму щурів та мише