РАЗДЕЛ 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Постановка эксперимента
Исследование выполнено на 96 крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г. В
качестве модели хронического воспаления было выбрано карагиненовое асептическое
гранулематозное воспаление, вызываемое по принципу предварительного создания
воздушного мешка и введением в него флогогена [168]. Для этого под кожу спины
животным вводили 8 мл стерильного воздуха. Через 24 часа в полученный подкожный
мешок вводили 4 мл 2% раствора л-карагинена в изотоническом растворе NaCl.
Предварительно раствор карагинена стерилизовали автоклавированием при 1210 С в
течение 15 мин. Все процедуры выполняли под эфирной анестезией. Сроки
воспаления отсчитывали от момента введения животным раствора карагинена.
Для облучения животных использовали источник g-излучения OB-6 (Германия) со
следующими параметрами: радиоактивный изотоп – 137Cs, радиоактивность – 20 Ci,
энергия фотонов – 660 кэВ, мощность поглощенной дозы – 14,3 мкГр/с на
расстоянии 1 м. Животные были размещены на расстоянии 1.6 м от источника, так
что мощность дозы облучения составляла 21 мГр/ч.
Животными были получены дозы 0.1, 0.5 и 1.0 Гр в течение 4.8, 24 и 48 часов
соответственно. Доза в 0.1 Гр лежит в области т.н. малых доз (менее 0.2 Гр или
1 трек на ядро), считавшихся до недавнего времени относительно безопасными
[159]. Доза в 1.0 Гр является классической радиобиологической дозой, эффекты
которой хорошо изучены при остром облучении. Доза в 0.5 Гр находится в
промежуточной области.
Первая серия животных была облучена к концу 3-х суток воспаления. При этом
первая группа животных была выведена из эксперимента непосредственно после
облучения. Выведение второй группы животных производили на 7-е сутки
воспаления.
Вторая серия животных была облучена к концу 7-х суток воспаления. При этом
первая группа животных была выведена из эксперимента непосредственно после
облучения. Выведение второй группы животных производили на 14-е сутки
воспаления.
Выбранные сроки хронического воспалительного процесса соответствуют пикам
макрофагальной (3-и сутки) и фибробластической (7-е сутки) пролиферации [168].
Полагая, что радиационная чувствительность является максимальной в эти периоды,
облучение производили к этим срокам.
Контролем служили животные, у которых вызвали воспаление, но облучению не
подвергали.
Детальное распределение животных по сериям и группам представлено в табл. 1.
Табл. 1
Количество животных
Доза облучения,
Гр
Животные, облученные к 3-м суткам воспаления
Животные, облученные к 7-м суткам воспаления
Выведение из эксперимента сразу после облучения
Выведение из эксперимента на 7-е сутки воспаления
Выведение из эксперимента сразу после облучения
Выведение из эксперимента на 14-е сутки воспаления
0 (контроль)
0,1
0,5
1,0
Всего
24
24
24
24
48
48
Животные всех экспериментальных групп находились в одинаковых условиях, водный
и пищевой режим – ad libitum. Для исключения влияния сезонных и суточных
колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в
осеннее-зимний период, в утренние часы. Опыты осуществляли в соответствии с
национальными «Общими этическими принципами опытов на животных» (Украина,
2001), которые согласуются с положениями «Европейской конвенции о защите
позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других
научных целей» (Страсбург, 18.03.1986 г.). Умерщвление животных проводили путем
декапитации под эфирным наркозом.
2.2 Определение хемилюминесценции биологических образцов
Для определения вероятности повреждения ДНК активными формами кислорода
использовали метод инициированной хемилюминесценции (ХЛ) ткани воспалительной
гранулемы и сыворотки крови.
Важнейшими преимуществами ХЛ как метода исследования биологических объектов
является бесконтактность (информация выносится из глубины клетки, с ее мембран
оптическим путем), неинвазивность, получение минимально искаженной в процессе
самого исследования информации о состоянии биологического объекта. Это выгодно
отличает ХЛ от большинства методов исследования биологических систем, к
непременным условиям которых чаще всего относятся фиксация тканей, разложение
на составные части полученных материалов, окраска и т.п. При этом
чувствительность ХЛ методов исследования на 2-5 порядков выше чувствительности
других методов (например, радиоиммунологического) [169, 170].
Интенсивность ХЛ характеризует ход реакций свободнорадикального перекисного
окисления, главным образом липидов, которое является непременным спутником
биологического обмена веществ. Свечение живых тканей в области длин волн
360-820 нм определяется свободнорадикальным окислением именно липидов в
присутствии молекулярного кислорода. Этот факт подтвержден многочисленными
экспериментами с использованием фотоэлектронных умножителей [171]. ХЛ является
следствием экзотермической реакции рекомбинации радикалов с образованием
возбужденных электронных состояний. Среди химических инициаторов перекисного
окисления липидов в живых системах центральное место занимают активные формы
кислорода: синглетный кислород, анион-радикал, супероксидный анион, перекись
водорода. Они образуются в клетке в результате многочисленных ферментативных и
неферментативных реакций, среди которых наиболее существенным является процесс
каталитического одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода.
Свободные формы кислорода, как известно, активно образуются как при воспалении,
так и в результате радиолиза воды при действии ионизирующих излучений.
Для приготовления фильтрата воспалительной г
- Київ+380960830922