РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Соединения и реактивы
Исследование фармакокинетики 1,4-бенздиазепинов и их предшественников было
проведено с использованием их радиоактивных аналогов: – [14C] –
7-бром-5-(о-хлор)-фенил-1,2-дигидро-3-гемисукцинат-2Н-1,4-бенздиазепин-2-она
(циназепам, уд. акт. 0,307 Cu/mole), [14C] – 7-бром- 5-
(о-хлор)-фенил-1,2-дигидро-3-окси-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она (3-оксифеназепам,
уд.акт. 0,214 Cu/mole), [14C] –
2-N-карбобензилглицил-глициламидо-5-бромбензофенона (ПАБФ, уд.акт. 1,5
Cu/mole), [14C] – 7-бром-5-фенил-1,2-дигидро-3H-1,4-бенздиазепин-2-она
(соединение I, уд. акт 0,27 Cu/mole) синтезированных в Одесском национальном
университете и в Физико-химическом институте им. А.В. Богатского НАН Украины.
В ходе научно-исследовательских работ также использовались: твин-80, тритон
Х-100, 2,5-дифенилоксазол (POPOP), 1,4-бис-2-(5-фенил) оксазолилбензол (PPO) и
жидкие сцинтилляционные смеси фирмы "СANBERA PACARD". Остальные реактивы
производства фирмы "Реахим" отечественного производства марки ч.д.а. и о.с.ч.
2.2. Подготовка животных к эксперименту
Опыты были проведены на нелинейных мышах массой 20 – 25 г. Экспериментальные
животные содержались на полноценной лабораторной диете при естественном
световом цикле. Исследуемые соединения вводили в изотоническом растворе
хлористого натрия и твиновой эмульсии (Тween-80). Были использованы
внутривенный, пероральный и внутрибрюшинный способы введения веществ
экспериментальным животным.
2.3. Методика проведения фармакокинетического эксперимента
2.3.1. Метод определения общего радиоактивного материала в органах и тканях
экспериментальных животных
Для изучения процессов фармакокинетики производных 1,4 – бенздиазепина в
организме мышей были использованы следующие схемы введения:
ПАБФ вводили мышам перорально в дозе 50 мг/кг. Через 0,5; 1, 2, 4, 6 и 24 часа
животных декапитировали и отбирались образцы тканей и крови. Внутривенно
препарат вводили в хвостовую вену мышей в дозе 50 мг/кг и через 0,17; 0,33,
0,5; 1, 2, 4, 6 и 24 часа и после декапитации отбирались образцы мозга и
крови.
Соединение I вводилось мышам внутрибрюшинно в дозе 1,4 мг/кг и после
декапитации через 0,17; 0,33, 0,5; 1, 2, 4, 6 часов отбирались образцы тканей и
крови.
Циназепам и 3-оксифеназепам вводили внутрибрюшинно в дозах 4 мг/кг и 2,8 мг/кг
соответственно. Образцы тканей отбирались через 0,5; 1, 2, 4, 6 часов
эксперимента.
Каждая экспериментальная группа состояла не менее, чем из 6 мышей. Для
определения общей радиоактивности у экспериментальных животных брали навески
органов – мозг, печень, селезенку, почки, сердце, скелетную мышцу, легкое и
жировую ткань и готовили гомогенаты в физрастворе в соотношении 1:5, отбирали
0,3 мл гомогената выше указанных органов и добавляли 20 мл толуол – спиртовой
сцинтилляционной жидкости.
Образцы крови помещали в центрифужные пробирки, омытые раствором антикоагулянта
– гепарина (500 IU/ml). Кровь центрифугировали в течение 10 мин при 2000 g и
весь отобранный объем супернатанта (плазма) помещали в сцинтилляционные
флаконы.
Определение радиоактивности проводили на сцинтилляционном счетчике Tri Carb
2700 (Canberra Pakkard).
2.3.2. Метод определения групп метаболитов производных 1,4 – бенздиазепина
Метод определения свободных, водорастворимых и связанных с белками метаболитов
основывался на двухфазной жидкость – жидкостной экстракции органическим
растворителем (хлороформом) из водной фазы (гомогенаты органов) свободных
метаболитов, разработанным ранее для экстракции метаболитов производных
1,4-бенздиазепина [164]. Группа метаболитов, связанных с белками выделялась из
водной фазы путем осаждения белков ТХУ и последующим центрифугированием. Осадок
растворяли в 1 мл муравьиной кислоты и 0,3 мл брали на определение
радиоактивности. Хлороформный экстракт выпаривался, и проба заливалась
толуольным сцинтиллятором. Для количественного определения радиоактивности
водорастворимых метаболитов из водной фазы после осаждения белков брали 0,3 мл.
Все измерения проводили на сцинтилляционном счетчике Tri Carb 2700 (Сanberra
Pakkard, USA).
2.3.3. Хроматографическое разделение свободных метаболитов производных
1,4-бенздиазепина
Широко распространенным и наиболее удобными является метод хроматографирования
и дальнейшее установление структуры индивидуальных соединений
физико-химическими методами. Разделение [14C] – бенздиазепинов и их метаболитов
проводили методом зонной радиохроматографии [165]. Хлороформные экстракты
биосубстратов наносили в виде линии 2,5 – 3 см на 3 см выше нижнего края
пластинки, общая длина которой составляла 15 см. Для отделения коэкстрактивных
веществ хроматография проводилась в четыреххлористом углеводороде в направлении
к нижнему краю пластинки. В этом случае бенздиазепины и его метаболиты остаются
на стартовой линии, а коэкстрактивные вещества (жиры, воска, пигменты и др.)
мигрируют. Часть пластинки на 1 см ниже стартовой линии отрезают и
хроматографируют в более полярной системе растворителей:
хлороформ:ацетон:аммиак – 3:1:0,01. Идентификация исходных соединений и их
метаболитов осуществлялась по значениям Rf синтезированных метчиков
(нерадиоактивных аналогов исходных соединений и их метаболитов) при облучении
хроматограмм УФ – светом (прибор "Хроматоскоп – 254"). Количественное
определение радиоактивности осуществлялось в толуол – спиртовом сцинтилляторе
на жидкостном сцинтилляционном счетчике.
2.4. Методы изучения процессов выделения 14C-циназепама
- Київ+380960830922