ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины и на базе Центра репродукции человека "Имплант" (г.Харьков)
2.1. Объекты исследования.
Объектом исследования были жидкость, содержащаяся в фолликулах яичника человека, спермии человека, культура эмбриональных фибробластов человека и клеток кумулюса и гранулезы.
Материалы диссертационной работы рассматривались на заседании комитета по биоэтике при ИПКиК НАН Украины. Выполненные исследования не противоречат биоэтическим нормам и действующему законодательству Украины, проводились в соответствии с приказом МЗУ №24 от 04.02.97 г, в соответствии с Хельсинской декларацией, Европейской конвенцией о защите прав и достоинств человека в связи с использованием достижений биологии и медицины (1987 г), ратифицированных в Украине.
2.2 Методика получения фолликулярной жидкости яичника человека.
ФЖ получали у женщин, проходивших курс лечения по поводу бесплодия при проведении программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Все женщины находились в репродуктивном возрасте (25-35 лет), не имели эндокринных нарушений и были обследованы на наличие урогенитальной инфекции (СПИД, сифилис, хламидиоз, уреаплазмоз, гарднереллез). В сборе анамнеза учитывали данные о наследственных заболеваниях, болезни Боткина, туберкулезе. В целях уточнения состояния репродуктивной функции супружеской пары и определения индивидуальной тактики лечения для всех исследуемых пациенток составляли график базальной температуры трёх последних менструальных циклов, оценивали проходимость маточных труб по данным гистеросальпингографии и анализировали данные ультразвукового исследования об анатомическом состоянии матки и яичников (размер, форма, рельеф органов и полости матки).
В программе ЭКО для получения когорты преовуляторных и зрелых фолликулов и, соответственно, нескольких ооцитов проводили стимуляцию фолликулогенеза, используя агонисты рилизинг-гормона (Suprefact"Hоechst"), человеческий фолликулостимулирующий гормон (Menogon"Serono") [142]. Мониторинг роста фолликулов у всех пациенток начинали с 8-го дня менструального цикла на ультразвуковом сканирующем устройстве Br(el ? Kj?r с использованием влагалищного секторального датчика. Жидкость из фолликулов получали на 12-14-й день менструального цикла после предварительной инъекции 5000-10000 ед. Profasi "Serono", который вводили за 34-36 часов перед пункцией фолликулов.
Фолликулы классифицировали по величине (малые с диаметром 13-15 мм и большие с диаметром 16-22 мм) и по качеству - нормальные, т.к. по морфологической оценке ооцит-кумулюсного комплекса качество ооцитов, полученных из фолликулов, относили, по данным эмбриологической группы, к зрелым. В некоторых исследованиях использовали отдельно ФЖ из пула малых или пула больших фолликулов. Всего в работе исследовано 200 образцов ФЖ яичника человека.
После выделения ооцитов из фолликулов ФЖ центрифугировали при 1500 g в течение 15-20 мин для осаждения клеток кумулюса и крови. Cупернатант в асептических условиях отбирали в стерильные пластиковые пробирки, помещали в термос на лед и транспортировали в течение 30-40 мин в ИПКиК НАНУ для проведения экспериментов. Образцы ФЖ человека, предназначенные для клинического применения и культивирования, подвергали бактериологическому и вирусологическому контролю.
2.3 Методика криоконсервирования и хранения фолликулярной жидкости человека.
Пулы ФЖ человека из малых и больших фолликулов делили на 3 части. Первый (контрольный) образец исследовали в течение 3-6 часов после получения. Второй и третий образцы расфасовывали в апирогенные пластиковые ампулы по 0,7-1,0 мл, маркировали и замораживали. Использовали два способа замораживания: 1-й - быстрое замораживание со скоростью 300-400?С в мин, которое достигалось путем непосредственного погружения ампул в дьюар с жидким азотом; второй способ заключался в двухэтапном криоконсервировании, первый этап - выдерживание образцов в парах жидкого азота в течение 20 мин на расстоянии 15 см над зеркалом азота, второй этап - погружение в жидкий азот. Ранее аналогичную программу замораживания ФЖ осуществляли на специальном приспособлении [138]. Для длительного хранения в течение одного года образцы ФЖ помещали в хранилище биопродуктов (ХБ-500) при температуре -196?С. Размораживание ФЖ осуществляли на водяной бане при температуре 37?С путём погружения ампул с образцом в воду на 10-12 с до начала образования жидкой фазы в первоначально замороженном образце. При выполнении работы в общей сложности было заморожено 324 ампулы образцов ФЖ человека.
2.4.Биохимические методы исследования фолликулярной жидкости.
2.4.1.Исследование перекисного окисления липидов фолликулярной жидкости человека.
2.4.1.1.Определение гидроперекиси липидов в фолликулярной жидкости.
Гидроперекиси липидов определяли по методу Асакава [139] в среде, содержащей 0,2М глициновый буфер (рН 3,6?, 0,3 мМ FeCl3, 0,3 мМ ионола. Окрашивание проводили с 2-тиобарбитуровой кислотой. Количество продуктов реакции определяли по оптической плотности в диапазоне длин волн 535-580 нм, принимая коэффициент молярной экстинкции равным 1,56?105 M-1см -1 .
2.4.1.2.Определение реактивных карбонилов в белках.
Определение реактивных карбонилов в белках, содержащихся в ФЖ человека, проводили по методу Левина [140] в модификации [141, 142]. ФЖ разводили 0,85%-ным водным раствором NaCl до концентрации 2мг белка на 1 мл и добавляли холодную ТХУ (конечная концентрация 10 % объём/объём). После десятиминутной инкубации при температуре 4°С образцы центрифугировали при 600 g в течение 15 мин, супернатант удаляли, а осадок суспендировали в 0,5мл 50мМ 2,4-динитрофенилгидрозина (ДНФГ) на 2 M HCl (опыт) или 0,5 мл 2 M HCl (контроль). Контрольные и опытные образцы инкубировали 60 мин при 37°С при постоянном перемешивании. После инкубации к образцам добавляли по 0,5 мл 20%-й ТХУ и цен