РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ, МЕТОДИ ТА УМОВИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Представлений в дисертації експериментальний матеріал одержано в результаті досліджень, що проводились впродовж 2003-2006 років в лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології УААН.
2.1. Об'єкти досліджень
Досліджували бульбочкові бактерії конюшини Rhizobium lеguminosarum bv. trifolii, які виділяли з кореневих бульбочок конюшини, та бобово-ризобіальну симбіотичну азотфіксувальну систему, яку вони утворювали з конюшиною лучною.
У дослідах також використовували штами:
- фосформобілізівних бактерій Enterobacter nimipressuralis 32-3 і препарат на його основі - фосфоентерин (ФМБ 32-3) (автори Л.О. Чайковська і Т.М. Мельничук). Біоагенти цього препарату не проявляють специфічності щодо виду рослин, тому препарат використовується для передпосівної бактеризації насіння різних сільськогосподарських культур з метою покращання живлення рослин фосфором за рахунок розчинення мінеральних фосфатів ґрунту під дією кислих продуктів бактеріального метаболізму і деструкції органофосфатів за рахунок синтезу та екскреції бактеріями ферменту фосфатази. Цей штам також є продуцентом речовин фітогормональної дії [168].
- асоціативного азотфіксатору, який виявляє антагонізм до фітопатогенних грибів - Paenibacillus polymyxa 6M і препарат на його основі біополіцид (БСП) (автори Шерстобоєв М.К., Шерстобоєва О.В., В.П. Патика) [189]. Препарат антифунгальної дії, пригнічує розвиток широкого спектру хвороботворних мікроміцетів, і тому ефективно використовується в сільському господарстві для передпосівної інокуляції насіння злакових, бобових та овочевих культур, не поступається за ефективністю знезараження насіння хімічним протруйниками фундазолу та максиму [178].
У дослідах використовували насіння конюшини лучної (Trifolium pratense L.) сортів Анітра і Спарта, які люб'язно надані директором Інститутом кормів УААН, доктором сільськогосподарських наук, професором В.Ф. Петриченком та сорт Носівська 5, наданий професором кафедри землеробства і гербології Національного аграрного університету Ю.П. Маньком.
Сорт Анітра селекції Інституту кормів УААН включений в державний реєстр сортів рослин України в 2001 році. Рекомендовані зони вирощування - Лісостеп, Полісся [130].
Сорт Спарта селекції Інституту кормів УААН включений в державний реєстр сортів рослин України в 2002 році. Рекомендовані зони вирощування - Лісостеп, Полісся [131].
Сорт Носівська 5 виведений на Носівській селекційно-дослідній станції в 1961 році та районований у зоні Полісся [95].
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Мікробіологічні і біохімічні методи досліджень
Виділення ізолятів з бульбочок конюшини проводили за загально прийнятим в ґрунтовій мікробіології методом [79]. Поверхню бульбочок стерилізували 0,1% розчином хлориду ртуті [17]. Розтерту масу бульбочок висівали в чашки Петрі на поживне середовище дріждже-манітний агар [163]. Через 5 діб колонії, що сформувалися на поверхні середовища відсівали в окремі пробірки зі скошеним дріжджо-манітним агаром. Чисті культури ізолятів одержували методом посіву та зберігали у пробірках на агаризованому живильному гороховому агарі для швидкорослих бульбочкових бактерій [163].
Нами було виділено бульбочкові бактерії з бульбочок конюшини, які відбирали за кращими фенотиповими показниками (табл. 2.1).
Морфологію клітин ізолятів вивчали за допомогою мікроскопії у фазовому контрасті, використовуючи мікроскоп LABOVAL 4 фірми Carl Zeiss Jena.
Таблиця 2.1
Виділення ізолятів з бульбочок конюшини
№
ізолятуКультураФаза
розвиткуМісце відбору зразківТип
ґрунтів1Конюшини повзучастеблуванняЧернігівдерново-підзолистий2Конюшини повзучастеблуванняЧернігівдерново-підзолистий3Конюшини повзучастеблуванняЧернігівдерново-підзолистий4Конюшини повзучастеблуванняЧернігівдерново-підзолистий5Конюшини повзучастеблуванняЧернігівдерново-підзолистий6Конюшини повзучастеблуванняЧернігівдерново-підзолистий7Конюшини лучнастеблуванняВінницятемно-сірий8Конюшини лучнастеблуванняВінницятемно-сірий9Конюшини лучнастеблуванняВінницятемно-сірий10Конюшини лучнастеблуванняЧернігівдерново-підзолистий11Конюшини лучнастеблуванняЛьвівсвітло-сірий12Конюшини лучнабутонізаціяЧернігівсвітло-сірий13Конюшини лучнабутонізаціяВінницятемно-сірий14Конюшини лучнабутонізаціяЛьвівсвітло-сірий15Конюшини лучнабутонізаціяВінницятемно-сірий16Конюшини лучнастеблуванняЛьвівсвітло-сірий17Конюшини лучнастеблуванняВінницятемно-сірий18Конюшини лучнастеблуванняЛьвівсвітло-сірий19Конюшини лучнастеблуванняЛьвівсвітло-сірий20Конюшини лучнастеблуванняЛьвівсвітло-сірий21Конюшини лучнабутонізаціяВінницятемно-сірий22Конюшини лучнабутонізаціяВінницятемно-сірий
Родову та видову належність бактерій встановлювали за здатністю утворювати бульбочки на коренях конюшини, морфологічними і основними фізіолого-біохімічними та культуральними ідентифікаційними ознаками [102].
Здатність нових штамів бульбочкових бактерій до продукції рістрегулюючих речовин визначали згідно методичних рекомендацій Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології РАСГН [78]. Насіння конюшини замочували впродовж 1 години у культуральній суспензії бульбочкових бактерій різного ступеню розведення, потім розкладали на зволожений фільтрувальний папір і витримували 4 доби при 28оС. Контролем слугувало насіння, замочене в стерильній воді. Через 4 доби рахували кількість пророслого насіння. Висушуванням при 105оС до постійної ваги визначали суху масу проростків.
Антифунгальну активність штамів Rh. lеguminosarum bv. trifolii визначали методом зустрічних культур [31]. Як тест-культури використовували фітопатогенні мікроміцети - збудники поширених хвороб сільськогосподарських культур Bipolaris sorokiniana, Trichotecium roseum і Fusarium avenaceum, які одержані з колекції Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.
Динаміку