РОЗДІЛ 2
ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал і методи досліджень
Об'єкт дослідження - плоди ВРХ отримані від клінічно здорових тварин в умовах м'ясопереробного підприємства "Ювілейний" Дніпропетровської області. Вік плодів встановлювали за масою та довжиною тіла, а також розвитком похідних шкіри за А.П. Студенцовим [264].
Для морфологічних досліджень шляхом анатомічного препарування відбирали тимус, селезінку, соматичні (нижньощелепний, поверхневий шийний, підколінний) і вісцеральні (каудальний середостінний, порожньої кишки) ЛВ разом із сполучною тканиною, яка їх оточує (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Матеріал дослідження
ОрганВік, місВсього23456789Тимус6666666648Селезінка6666666648Лімфатичні вузли:нижньощелепні121212121212121296поверхневі шийні121212121212121296підколінні121212121212121296каудальні середостінні6666666648порожньої кишки6666666648Всього6060606060606060480 Визначали абсолютну масу органів за допомогою терезів ВЛІТ-500-М, із точністю до 0,001 г. Вираховували відносну масу органів (до маси плоду).
Цілі лімфоїдні органи швидко охолоджували шляхом фіксації в 5,0%-му розчині нейтрального формаліну (з температурою не більше 4°С) і витримували при цій температурі (у холодильнику) протягом 24-48 годин. Подальшу фіксацію проводили при кімнатній температурі в 10,0%-му розчині формаліну протягом 10-30 діб.
Після фіксації органи розрізали лезом на паралельні пластини однакової товщини (біля 1-5мм), враховуючи їх гістоархітектоніку, з метою отримання найбільш адекватного відображення на тотальних зрізах характерних тканинних співвідношень.
Тимус розрізали у сегментальній площині, перпендикулярно магістральним судинам і шиї. Для виготовлення тотальних зрізів відбирали по декілька пластин із кожної частки (парних і непарних ділянок шийної та грудної) у місцях, які мають максимальну ширину.
Селезінку розрізали у фронтальній площині, перпендикулярно її продольній вісі та відбирали пластини із середньої частини органа.
ЛВ розрізали перпендикулярно до їх воріт. Від кожного вузла відбирали 1-2 серединні сегменти. Невеликі вузли плодів раннього плідного періоду (2-4 міс) для гістологічних та цитологічних досліджень використовували цілими.
Для отримання оглядових препаратів, проведення морфометричних та цитологічних досліджень фрагменти органів заливали у парафін. Попередньо сегменти органів промивали під проточною водою протягом 6-12 год, зневоднення проводили в етиловому спирті зростаючої концентрації [265]. Для підвищення стійкості блоків при заливанні органів у парафін, використовували розчини органічного скла. Основний розчин органічного скла: 20 гр подрібненого органічного скла на 1 л хлороформу. Перший робочий розчин: 200 мл основного розчину, 200 мл 96%-го етилового спирту, 200 мл хлороформу; другий робочий розчин: 200 мл основного розчину і 200 мл хлороформу; третій робочий розчин - 200 мл основного розчину. У кожному робочому розчині зневоднені сегменти органів витримували по 2-3 години і після цього переносили в розчин хлороформ-парафіна (1:1) на 6-12 годин при температурі 37 °С. Після цього за загальноприйнятими методиками заливали у парафін [266]. Із парафінових блоків на санному та ротаційному мікротомах готували тотальні гістозрізи для оглядових препаратів товщиною 7-10 мкм, для цитологічних досліджень 3-5 мкм.
Для з'ясування особливостей структурних перетворень ретикулярної строми органів і гістохімічних досліджень на мікротомі-кріостаті МК-25М виготовляли заморожені зрізи при температурі не нижче (-)15-(-)18 °С. Сегменти органів промивали в проточній воді протягом 12-24 год для максимального видалення з них формаліну. Для надійної фіксації пластин органів до столика мікротома, використовували 4%-й водний розчин желатину. Після вирівнювання блоку на поверхню примерзлої пластини за допомогою очної піпетки наносили гліцерин-желатинову суміш [267]. Зріз виготовляли зразу ж після застигання суміші, потім наносили нову порцію та робили наступний зріз і так не менше 10 зрізів із кожної пластини органу, товщиною 15-30 мкм. Після виготовлення, гістозріз із мікротомного ножа препарувальною голкою переносили на попередньо оброблене білок-гліцерином (1:1) предметне скло.
Парафінові гістозрізи товщиною 7-10 мкм забарвлювали гематоксиліном Ерліха та еозином за загальноприйнятою методикою [265], проте використовували тільки 96%-й етиловий спирт і спиртові розчини еозина, та просвітляли забарвлені гістопрепарати у бальзам-ксилолі (1:10 і 1:20). Тонкі парафінові зрізи (3-5мкм) забарвлювали за Ван-Гізон, азур II - еозином, метиловим зеленим - піроніном за Браше [266] (табл.2.2).
Заморожені гістозрізи лімфоїдних органів для імпрегнації сріблом за Футом безпосередньо після виготовлення переносили в кристалізатор із дистильованою водою (температура + 30-35°С). У теплій воді гліцерин-желатинова суміш розчинялася і зрізи опускалися на дно. Після цього скляною паличкою їх переносили у другий кристалізатор із дистильованою водою на 3-6 год для промивання. Подальшу імпрегнацію проводили згідно загальноприйнятої методики у модифікації П.М. Гавриліна [268] (табл. 2.2).
Для забарвлення заморожених зрізів тимуса суданом ІІІ відмивання гліцерин-желатинової суміші проводили шляхом їх занурення у теплу (до 40-50°С) воду. Відмиті від гліцерин-желатинової суміші зрізи забарвлювали суданом ІІІ (за Герксгеймером) із подальшим дозабарвленням гематоксиліном Ерліха. Гіспопрепарати заключали у 2%-й водний розчин желатину [269, 270] (табл. 2.2).
Таблиця 2.2
Розподіл матеріалу за методиками досліджень
ОрганМетодикиморфометрія (маса)гістологічнігістохімічнізабарвлення гематоксиліном-еозиномзабарвлення за Ван-Гізонімпрегнація срібломзабарвлення азур ІІ-еозиномзабарвлення за Браше (метиловим зеленим-піроніном)забарвлення суданом ІІІТимус48488-2489Селезінка4848816248-Лімфатичні вузли:н
- Київ+380960830922