РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Матеріалом для морфологічного вивчення передсердно-шлуночкових клапанів серця в онтогенезі послужили 96 сердець ембріонів, плодів та людей різних вікових груп (табл. 2.1).
Розподіл анатомічного матеріалу було проведено на підставі схеми вікової періодизації життя людини, запропонованої Л.К.Семеновою (1986).
Таблиця 2.1
Розподіл матеріалу дослідження передсердно-шлуночкових клапанів
серця протягом онтогенезу
СтатьПренатальний період Постнатальний періодембріониплодиIIIIIIIVVВСЬОГОчоловіки467587542жінки3396519954ВСЬОГО798096
I - новонароджені та діти грудного віку;
II - дитинство;
III - підлітковий вік;
IV - зрілий вік
V - похилий вік.
Увесь матеріал розподілили на два окремих періоди життя. Перший пренатальний період складали серця ембріонів та плодів, а другий - серця постнатального періоду розвитку. У пренатальному періоді матеріалом послужили ембріони та плоди загальною кількістю 16 сердець, частка яких була використана із архіву кафедри анатомії Дніпропетровської державної медичної академії. В постнатальному онтогенезі було виділено п'ять вікових груп: I- новонароджені та грудні (від 1 дня до 1 року); II- дитинство (від 1 року до 11 років); III- підлітки (від 12 років до 21 року); IV- зрілий вік- (від 22 років до 60 років); V- похилий вік (від 61 року до 75 років).
Такий розподіл постнатального матеріалу і виділення цих вікових груп дозволили з високою долею ймовірності відобразити найбільш важливі періоди становлення, стабілізації й інволюції морфо-функціональних процесів, що відбуваються у передсердно-шлуночкових клапанах протягом постнатального онтогенезу.
Комісією з етичних питань та біоетики Дніпропетровської державної медичної академії (протокол №2 від від 14 лютого 2007 року) встановлено, що проведені дослідження відповідають принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ Міжнародної ради медичних, наукових товариств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983 р.) та законам України [24].
Забір матеріалу для анатомічного дослідження проводили у морзі Дніпропетровського обласного бюро судово-медичної експертизи, у морзі Дніпропетровської обласної дитячої клінічної лікарні, а також у патологоанатомічних відділеннях лікарень міста Дніпропетровська.
2.2. Методи дослідження
Для виконання поставлених задач дослідження були використані морфологічні та морфометричні методи [1]. Результати отриманних даних оброблялися за допомогою варіаційно-статистичного аналізу.
2.2.1. Морфологічні методи:
А) Макроскопічне препарування
З грудної порожнини людей досліджуваних вікових груп вилучали серце, після його промивання під проточною водою серце поміщали в 10% розчин нейтрального формаліну. Після фіксації переходили до анатомічного препарування та виготовлення топографічних зрізів на рівні передсердно-шлуночкових клапанів. Матеріал дослідження у вигляді шматочків з різних відділів передсердно-шлуночкових клапанів серця розмірами до 1см3 також фіксували у 10% розчині формаліну. Проводка препаратів здійснювалась за стандартною схемою.
Б) Виготовлення топографічних зрізів на рівні передсердно-шлуночкового отвору
На фіксованому серці паралельно площині вінцевого синуса відсікали передсердя, до фіброзного кільця передсердно-шлуночкових отворів. Далі проводили відсікання окремо кожної стулки клапану до місця сполучення її з фіброзним кільцем та підклапанним хордопапілярним апаратом. Після чого проводився опис структурних компонентів клапанного апарату за допомогою кількісої морфології.
В) Гістологічні методи
Для вивчення особливостей змін структурних компонентів клапанного апарату серця в онтогенезі, виявлення сполучнотканинних та м'язових елементів проводилося виготовлення серійних гістологічних зрізів (забарвлення гематоксиліном-еозином, залізним гематоксиліном Гейденгайна, та забарвлення за методом Маллорі-Слінченко).
Матеріал дослідження у вигляді шматочків різних відділів серця розміром до 1см3 фіксували у формаліні. Проводка здійснювалась за стандартною схемою. Матеріал зневоднювали у спиртах із зростаючою концентрацією, спирт вилучали за допомогою ксилолу, потім заливали зрізи у парафін.
На мікротомі виготовляли зрізи товщиною 5-7 мкм., що проходили через передседно-шлуночковий клапан, стулку клапана, сухожилкову струну, сосочкоподібний м'яз. Мікроморфометричні дослідження гістологічних зрізів міокарда проводили за допомогою окулярметрометру і окулярної вимірювальної сітки мікроскопу.
Перед фарбуванням зрізи знежирювали етиловим спиртом 96%. Фарбували на предметному склі протягом 15 хв. гематоксиліном. Потім переносили зріз в 1% розчин HCl на 1 хв., після чого для видалення кислоти промивали водою 20 хв., зрізи поміщали на предметне скло і фарбували 1% еозином. Заливали на 1,5 хв. і змивали водою. Заливали на 3 хв. 96% спиртом, потім зливали його і заливали ксилолом тричі по1 хв. для освітлення, потім занурювали в бальзам.
На ранніх стадіях розвитку серця забарвлювали зрізи залізним гематоксиліном Гейденгайна з метою виявлення розвитку елементів кардіогелю, на більш пізніх стадіях розвитку використовували забарвлення за Маллорі-Слінченко, для виявлення сполучної тканини, а саме елементів колагенових та еластичних волокон фіброзного кільця та клапанів серця.
Підготовка препаратів для морфометричного аналізу включала фарбування отриманих напівтонких зрізів з використанням залізного гематоксиліну Гейденгайна.
Для цього зрізи заздалегідь обробляли 2,5%-ним розчином залізо-аміачних квасків протягом 6 хвилин при температурі +60?С і забарвлювали розчином Гейденгайна (0,5 г гематоксиліну в 10 мл етанолу і 90 мл дистильованої води) протягом 4 хвилин при температурі +70?C. Післ