РАЗДЕЛ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Реализация задач настоящего исследования проведена на 183 белых крысах-самцах линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария. В эксперименты включали животных в возрасте 2 - 3 мес. массой 200 - 300 г без признаков заболеваний. Перед проведением исследований крыс в течение недели адаптировали к лабораторным условиям и персоналу.
Для достижения цели исследования - выяснения влияния вегетативной регуляции на течение синдрома системного воспалительного ответа - было проведено несколько серий экспериментов. Использованные в работе протоколы исследований были разработаны в соответствии с положениями международных принципов гуманного обращения с животными, изложенными в Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publ. No. 93-23, revised 1985), Законом Украины № 3447-IY от 21.02.2006 "О защите животных от жестокого обращения" и положением Комитета по биоэтике ДонГМУ о Порядке использования животных в экспериментальных исследованиях и одобрены Комиссией по биоэтике Донецкого государственного медицинского университета им. М. Горького. Животных выводили из эксперимента путем декапитации.
Первая серия исследований была посвящена модификации технологии спектрального анализа вариабельности сердечного ритма к работе с крысами. Такая необходимость обусловлена отсутствием на сегодняшний день единых стандартов по использованию данного метода у мелких лабораторных животных.
В общей сложности у 20 животных зарегистрировали 164 десятиминутных записи ЭКГ, которые послужили материалом для оценки приемлемости подходов к оценке стационарности процессов, выбора адекватного математического метода спектрального преобразования, расчета
38 оптимальной длины анализируемого участка и определения диапазонов частот для оценки вегетативных влияний.
Для предупреждения регистрации переходных процессов в состоянии вегетативной регуляции крыс, и, следовательно, повышения воспроизводимости результатов спектрального анализа вариабельности сердечного ритма, у этих животных в разные дни регистрировали кардиоритмограммы в состоянии наркотического сна. Использованы следующие анестетики: кетамин 75 мг/кг в/м, тиопентал-натрий 75 мг/кг в/п и галотан 0,5% Чтобы определить, сохраняется ли в этих условиях реактивность вегетативной нервной системы, в отдельных экспериментах анестезированным животным проводили пробу с фармакологической стимуляцией ?-адренорецеторов - однократно внутримышечно вводили фенилэфрин в дозе 2 мг/кг.
Во второй серии экспериментов (рис. 2.1) у 29 крыс изучали зависимость между состоянием и реактивностью различных звеньев вегетативной нервной системы и выживаемостью крыс в условиях модели синдрома системного воспалительного ответа. С использованием технологии спектрального анализа вариабельности сердечного ритма изучили исходное состояние вегетативной регуляции и ее реакцию в ответ на стимуляцию ?-адренорецепторов с помощью фенилэфрина в той же дозировке. Затем моделировали синдром системного воспалительного ответа с помощью общепринятого метода перевязки и пункции слепой кишки. Спустя 2 ч после окончания операции снова оценивали вегетативный статус животных. Впоследствии за животными наблюдали, регистрируя их 10-суточную выживаемость.
39
Рис. 2.1. Схема эксперимента по изучению влияния вегетативной нервной системы на выживаемость крыс в условиях модели системного воспалительного ответа
* у 1-йиЗ-г крыс из групп с Еотагагфижкыли тЕ'.па.-'оприятнъмпрогносом соответственно наЬлнщашлетапЕные исходы Эгинивотны* были исключены из наблюдении.
Рис. 2.2. Схема эксперимента по изучению влияния вегетативной нервной системы на выраженность повреждения внутренних органов в условиях модели системного воспалительного ответа
40
Рис. 2.3. Схема эксперимента по изучению влияния стимуляции N-холинорецепторов на выживаемость крыс в условиях модели системного воспалительного ответа
Рис. 2.4. Схема эксперимента по изучению влияния стимуляции N-холинорецепторов на выраженность повреждения внутренних органов в условиях модели системного воспалительного ответа (плацебо-группа крыс на схеме не отображена)
41
В третьей серии экспериментов (рис. 2.2) изучали индивидуальные особенности выраженности метаболических нарушений во внутренних органах крыс, различающихся состоянием и реактивностью вегетативной нервной системы. На основании результатов, полученных в предыдущих сериях, с помощью спектрального анализа вариабельности сердечного ритма животных третьей серии (54 крысы) предварительно делили на контрольную группу (12 животных) и группы с благоприятным и неблагоприятным прогнозом для жизни в модели синдрома системного воспалительного ответа (20 и 22 животных соответственно). После того, как модель воспроизводили, через каждые 2 ч методом декапитации выводили по три особи для отслеживания динамики изменения концентрации малонового диальдегида, каталазы, ?-токоферола, лактатдегидрогеназы и катепсина Д в тканях сердца, легких, печени и почек. На 8 ч наблюдения из эксперимента выводили по 10 крыс с благоприятным и неблагоприятным прогнозом для изучения корреляционных связей между биохимическими показателями и спектральными характеристиками вариабельности сердечного ритма.
В экспериментах четвертой серии на 20 крысах были подобраны такие дозы неостигмина (100 мкг/кг п/к) и атропина (50 мкг/кг п/к), чтобы при сочетанном введении они были физиологически эквивалентными в отношении М-холинорецепторных эффектов - частота сердечных сокращений и артериальное давление менялись не более чем на 5%., что позволяло избирательно стимулировать N-холинорецепторы.
Для выяснения влияния N-холинорецепторного противовоспалительного пути на прогноз для жизни у 21 крысы в модели синдрома системного воспалительного ответа через каждые 2 часа повторяли сочетанные инъекции неостигмина и атропина в течение 8 ч. Выживаемость оце