РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
У даному розділі наведені об'єкти та методи досліджень, які повніше відображають характер виконаної роботи і вирішення поставленої проблеми.
Об'єктами досліджень нами обрано наступні групи чотири групи БАР - N-(2-аминобензоил)-L-триптофан, похідні 4,3?-спіро-[(2-аміно-3-R-4Н-пірано)-2?-оксоіндолу], похідні 4-(1H-індол-3?-іл)-2-аміно-4Н-пірану та похідні 3-індоліл-2-оксоацетамідів, для синтезу яких нами використані загальноприйняті прийоми органічного синтезу.
2.1 Синтез напівпродуктів
Для одержання сполук, що є об'єктами досліджень дисертаційної роботи необхідно було, перш за все, здійснити синтез деяких напівпродуктів. Основні методи одержання вихідних сполук, а також деяких інших реагентів, необхідних для виконання поставлених синтетичних завдань, наведені в даному розділі.
Гідрохлорид метилового естеру L-триптофану одержаний з L-триптофану промислового виробництва за методикою [172].
Етиловий естер 4Н-3,1-бензоксазин-4-он-2-карбонової кислоти (3.7) та відповідні N-R-аміди синтезовані за методикою роботи [173]. Вихідні N-арилантраніламіди (3.13a-d) були отримані згідно методу, описаному в роботі [172].
Вихідний 3-індолілгліоксилхлорид отримували за модифікованою методикою при взаємодії індолу з оксалілхлоридом в абсолютному ТГФ при 0-5 оС, отриманий після стояння в холодильнику при температурі не вище +5 оС осад продукту впродовж 1 год негайно використовували для синтезу.
Вихідні N-бензил- та N-метил похідні ізатину, 5-метил-, 5-нітро- та 5-бромізатинів отримували за методикою описаною в роботі [174], але для отримання натрієвої солі ізатину використовували еквімолярну кількість етилату натрію замість 10% гідроксиду калію. 5-Метилізатин отримували циклізацією ізонітрозоацетамідів за Зандмейером згідно методиці описаній в роботі [175].
5-Бромізатин синтезували за модифікованою методикою [174], тобто замість того щоби пропускати газоподібний хлор впродовж 6-8 год після додавання 2 кратного надлишку брому, як описано у вищезгаданій методиці, до розчину ізатину в соляній кислоті по краплям прикапували бром (3,5 моль брому на 1 моль ізатину), а потім перемішували реакційну суміш при охолодженні ще 2 год, а для виділення 5-бромізатину розчин розбавляли водою, промивали осад водою та сушили на повітрі. Це дозволило уникнути незручностей у роботі з газоподібним хлором. 5-Нітроізатин отримували згідно методиці [174].
3-Форміліндол було отримано за відомою методикою з індолу при дії реактиву Вільсмеєра [45].
2.2 Методи досліджень
2.2.1 Фізико-хімічні методи досліджень
При вивченні властивостей об'єктів дослідження використані фізико-хімічні методи, що дозволяють об'єктивно оцінити їх якість, базуючись на одержаних результатах. Вивчення деяких фізико-хімічних властивостей одержаних речовин проводилися за методиками, наведеними в Державній Фармакопеї України (ДФУ, вид. 1) [176].
Температури плавлення визначали капілярним способом ([176], 2.2.14) на приладі ПТП (М). Елементний аналіз проводили на аналізаторі Carlo Erba CHNS-O EA 1108, де відхилення не перевищувало ±0,4%.
Спектри ЯМР 1Н реєстрували на приладі Varian M-200 з робочою частотою 200 мГц в ДМСО-d6, внутрішній стандарт тетраметилсілан.
Спектри ЯМР 13С реєстрували на приладі GEMINI-400 VARIAN, робоча частота на протонах 100.61 Мгц в ДМСО-d6, внутрішній стандарт тетраметилсілан. АРТ (Attached Proton Test) 13С спектри знімали на цьому ж приладі.
Масс-спектри реєстрували на приладі Varian 1200L методом прямого введення проб, енергія іонізації 70 еВ, температура іонізаційної камери 50-150 ?С.
ІЧ-спектри вимірювали на спектрофотометрі Specord M-80 в таблетках KBr (концентрація речовини 1%) ([176], 2.2.24). УФ-спектри виміряні на спектрофотометрі Specord M-40 в етанолі ([176], 2.2.25).
Рентгеноструктурне дослідження синтезованих сполук проводилось в лабораторії рентгеноструктурного аналізу ДНУ НТК "Інститут монокристалів" НАН України під керівництвом д.х.н., проф. О.В. Шишкіна. Параметри елементарного осередку, інтенсивності та відзеркалень виміряно на дифрактометрі "Xcalibur-3" (MoK випромінювання, ССD-детектор, графітовый монохроматор, ?-сканування, 2макс= 50). Структура розшифрована прямим методом по комплексу програм SHELXTL [177].
2.2.2. Біологічні методи досліджень
Антимікробну активність серії синтезованих гетероциклічних сполук вивчали на кафедрі мікробіології НФаУ під керівництвом проф. І.Л. Дикого. Дослідження проводили in vitro методом двократних серійних розведень в рідкому живильному середовищі [178] з використанням набору референтних штамів грампозитивних та грамнегативних бактерій, включаючи S. aureus АТСС 25923, B. subtilis АТСС 6633, E. coli АТСС 25922, P. aеruginosa АТСС 25853 та дріждівих грибів С. albicans АТСС 885653.
Бульйон Сабуро та м'ясо-пептонний бульйон розливали по 1 мл в 10 пробірок. В першу пробірку вносили 1 мл розчину антибактеріального хіміопрепарату у концентрації 1 мг/мл.
Після перемішування переносили мірною піпеткою 1 мл з цієї пробірки в другу, перемішували і переносили ту ж кількість суміші з другої в третю і т. д. до дев'ятої пробірки, з котрої 1 мл виливали. Десяту пробірку, що не містила препарат, використовували як контроль.
В усі пробірки вносили однакові кількості зависі тест-культури. Для цього 18-годинну культуру досліджуваного мікроорганізму на косому агарі змивали фізіологічним розчином, доводили до густоти 5 ЕД з наступним розведенням до потрібної кількості мікробних клітин в 1 мл і вносили в пробірки з серійно розведеним препаратом. Результати враховували, визначаючи наявність або відсутність росту мікроорганізму в середовищі, що містить різні розведення антибактеріального хіміопрепарату.
Для визначення бактерицидної концентрації з 2 - 3 останніх пробірок з відсутністю видимого росту робили посів на агар або бульйон. Через 24 год інкубації в термостаті відмічали найменшу концентрацію антибактеріального