РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт і матеріал досліджень
Дослідження проводились на 120 безпородних білих щурах масою 150-180 г, яких утримували у віварії. Всього проведено 4 варіанти досліджень, приведених нижче.
Варіанти дослідів:
І. Дослідження впливу катіонів свинцю на еритропоез і лейкопоез за умов одноразового парентерального введення ацетату свинцю лабораторним щурам. Тварин досліджували через 1, 3 і 10 діб після введення ацетату свинцю.
ІІ. Дослідження метаболічних ефектів катіонів свинцю в еритроцитах щурів за умов одноразового парентерального введення ацетату свинцю. Тварин досліджували через 1, 3 і 10 діб після введення ацетату свинцю.
ІІI. Дослідження метаболічних ефектів катіонів свинцю в лімфоцитах щурів за умов одноразового парентерального введення ацетату свинцю. Тварин досліджували через 1, 3 і 10 діб після введення ацетату свинцю.
ІV. Дослідження коригуючого впливу вітаміну Е (б-токоферолу ацетат) на процеси пероксидного окиснення ліпідів та активність ферментів антиоксидантної системи в еритроцитах і лімфоцитах щурів, інтоксикованих ацетатом свинцю. Тварин досліджували через 3 і 10 діб після введення ацетату свинцю і б-токоферол ацетату.
Ацетат свинцю вводили тваринам шляхом одноразової внутрішньочеревної ін'єкції у дозі 10 мг Pb/кг маси тварин. При виборі дози токсиканта користувались даними літератури [164, 184, 318].
Вітамін Е (б-токоферолу ацетат) в дозі 300 мг/кг маси вводили тваринам перорально щодоби впродовж трьох діб після введення ацетату свинцю. Для дослідження використовували тварин на 3-тю і 10-ту доби експерименту.
Матеріалом дослідження була змішана периферична кров, яку отримували шляхом декапітації тварин дослідних і контрольної груп.
Дослідження кількості клітин крові (еритроцити і лейкоцити) здійснювали за допомогою підрахунку в камері Горяєва, відносний вміст паличкоядерних і поліморфоядерних нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів визначали шляхом цитологічних досліджень мазків крові [34]. Відносний вміст популяцій еритроцитів крові (молоді, зрілі і старі клітини) визначали фракціонуванням в градієнті густини сахарози [50].
Для отримання еритроцитів гепаринізовану кров центрифугували на рефрижераторній центрифузі при 2500 g протягом 15 хв. Плазму відбирали, а клітини трьохкратно промивали фізіологічним розчином (0,85 % NaCl) з наступним центрифугуванням при 3000 g протягом 5 хв [34].
Різновікові фракції еритроцитів отримували фракціонуванням суспензій клітин у градієнті густини сахарози згідно з методом, який базується на змінах плавучої густини еритроцитів при дозріванні [50, 246, 286]. Для розділення клітин за плавучою густиною використовували концентрації моносахариду 30%, 24%, 18%, 12% і 6%. Із семи отриманих фракцій еритроцитів формували три фракції (молоді, зрілі, старі клітини) на основі цитологічного аналізу [50, 53]. Відносний вміст еритроцитів кожної фракції визначали спектрофотометрично.
Лімфоцити гепаринізованої крові виділяли методом диференційного центрифугування в градієнті густини фіколу і верографіну [85, 235].
Лізис клітин крові проводили бідистильованою водою шляхом трьохкратного заморожування-відтаювання у рідкому азоті. Лізати клітин центрифугували при 15000 g протягом 30 хв з охолодженням (4°С).
Статистичну обробку результатів здійснювали в режимі програмного забезпечення на персональному комп'ютері ІВМ РС із використаням критерію Стьюдента.
2.2. Визначення концентрації гемоглобіну та спорідненості білка з киснем
Концентрація гемоглобіну. Концентрацію гемоглобіну в гемолізатах визначали після переведення його в ціанметформу за методом Драбкіна [130]. Розрахунок проводили за формулою:
E Ч 100
Смм = -------- , де
10,99 Ч 4
E - оптична густина; 10,99 - мілімолярний коефіцієнт екстинції ціанметгемоглобіну при 540 нм; 4 - коефіцієнт перерахунку від одного гема на тетрамер; 100 - розведення лізату.
Спорідненість гемоглобіну з киснем. Визначення спорідненості гемоглобіну з киснем здійснювали методом побудови кривих кисневої рівноваги гемоглобіну. Він базується на різницях у спектрах поглинання оксигенованого і деоксигенованого білка. Для досліджень використовували десатуратор, що складається з тонометра, системи дозування і обміну газового складу [55, 56]. Спектрофотометричні дослідження здійснювали в інтервалі 400-800 нм. Концентрація білка в гемолізатах становила 4,5-5,0 . 10-5 моль/л.
Деоксигенацію розчину гемоглобіну проводили при температурі 370С, контролюючи ступінь перетворення білка в деоксиформу спектрофотометрично. Для цього використовували орієнтовний критерій повної деоксигенації гемоглобіну Е555/Е540 >1,24, виведений за відповідними мілімолярними коефіцієнтами екстинкції гемоглобіну. До розчину деоксигемоглобіну в кювету десатуратора вводили порцію CO2 для створення його парціального тиску 5,32 кПа (відповідно до рСО2 у венозній крові). Кювету термостатували при 370С протягом 10 хв, після чого вимірювали оптичну густину розчину деоксигемоглобіну при 558 нм. Поступовим додаванням дозованих порцій повітря збільшували рО2 в тонометрі і після тонометрування протягом 15 хв вимірювали оптичну густину розчину білка. Реєстрували 5-7 вимірів, на підставі яких будували криві залежності ступеня насичення гемоглобіну киснем (%) від парціального тиску кисню (кПа). Спорідненість гемоглобіну до кисню оцінювали за допомогою показника Р50 - величиною рО2, при якій гемоглобін вивільняє 50% зв'язаного кисню.
2.3. Визначення концентрації лактату і 2,3-дифосфогліцерату в еритроцитах
Лактат. Концентрацію лактату визначали у позбавленому від білків екстракті клітин за допомогою ферментного методу [76]. Білки осаджували додаванням 0,5 М HClO4 і центрифугуванням при 6000 g протягом 10 хв. Визначення концентрації лактату здійснювали в 0,1М тріс-гідразиновому буфері (рН 9