Глава 2
Материалы и методы исследования
2.1. Объекты и модели исследования
Экспериментальная часть выполнена на 84 белых мышах, 436 половозрелых белых
крысах самцах, массой 200- 250 г. и 70 монгольских песчанках (гербелах) массой
45 – 60 г. Животные получены из питомника Института фармакологии и токсикологии
АМН Украины. Животные содержались на стандартном рационе питания, при
естественной смене дня и ночи. Все экспериментальные процедуры осуществляли в
соответствии с «Положением об использовании животных в биомедицинских
исследованиях» [163].
Поскольку целью нашей работы являлось исследование нейропротективной
активности глицина и его комбинаций, то были необходимы адекватные
экспериментальные модели, адекватны клиническим проявлениям инсульта, в
частности, способны воспроизводить основные цереброваскулярные феномены:
диффузное снижение мозгового кровотока, энергетический дефицит,
глутамат-кальциевую эксайтотоксичность, оксидативный стресс, экспрессию генов
раннего реагирования и т.д. Таким требованиям соответствует модель необратимой
билатеральной окклюзии общих сонных артерий, которую мы использовали для
воспроизведения ишемического инсульта на белых крысах. Процедуру по перевязке
общих сонных артерий выполняли под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг
внутрибрюшинно). Путем хирургического доступа выделяли общие сонные артерии,
подводили под них шелковые лигатуры и перевязывали [164].
Для воспроизведения клинической картины геморрагического инсульта нами была
использована модель кровопускания аутокрови под твердую оболочку головного
мозга. Для этой цели использовали белых крыс. Животных наркотизировали
этаминал-натрием (40 мг/кг внутрибрюшинно), голову фиксировали в держателе
стереотаксиса, делали надрез кожи на голове и сверлом разрушали твердую
оболочку головного мозга, под которую вводили аутокровь, взятую из хвостовой
вены [165].
При использовании в экспериментах монгольских песчанок нами учитывались видовые
анатомические особенности кровоснабжения головного мозга у этих животных, а
именно разобщенность веллизиевого круга мозгового кровообращения. Поэтому на
этих животных использовалась модель обратимой двусторонней окклюзии сонных
артерий, путем наложения окклюдера на фоне артериальной гипотензии. Операцию
выполняли под наркозом этаминал-натрием, который вводили внутрибрюшинно в дозе
40 мг/кг веса животного. Артериальную гипотензию вызывали введением пентамина в
дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно. Длительность наложения окклюдера составляла 30
минут, после чего наступала реперфузия [166].
Все исследуемые соединения вводили животным внутрибрюшинно один раз в сутки
начиная с выхода крыс с наркоза на протяжении 4 суток (острый период
ишемического и геморрагического инсульта) и 18 суток (восстановительный
период). Терапию гербелов проводили на протяжении одних суток (острый период) и
7 дней после моделирования ишемии-реперфузии.
Исследовались такие препараты: глицин в дозе 200 мг/кг, MgCl2 – 15 мг/кг,
«Магнелонг» – 1 мл иньекционного раствора на 100 г массы. Как препарат
сравнения использовали пирацетам, который вводили в дозе 500 мг/кг.
Лекарственная комбинация «Магнелонг» была создана при участии заведующего
кафедрой технологии лекарственных средств ЗГМУ В.В.Головкина. Она содержит
магния хлорид (1,5 г), глицин (2,0 г), г-аминомасляную кислоту (2,5 г), воду
дистиллированную (до 100 мл).
2.2 Фармакологические и токсикологические методы.
Для изучения дозозависимости глицина использовали белых мышей, с которыми
проводили гипоксический тест. Животных помещали в герметично закрытый сосуд,
вызывая гипоксическую гипоксию [167]. О степени антигипоксической активности
судили по удлинению времени до первого апноэ у животных. Вторую серию
исследований по дозозависимости проводили на белых крысах. Животным
моделировали амнезию путем введения атропина (40 мг/кг внутрибрюшинно). О
наличие антиамнестической активности судили по сохранению аверсивного стимула в
тесте условной реакции пассивного избегания (УРПИ) [168].
У животных, которым моделировали разные типы острого нарушения мозгового
кровообращения, оценивались реакции ориентировочно - исследовательского
поведения в тесте «открытое поле». Животное помещали в угол камеры (100 : 100
см) с пластмассовыми стенками высотой 40 см и наблюдали за ее поведением в
течение трех минут. Полом служил лист бежевого цвета, на который черной краской
нанесена решетка, делящая поле на 25 (5 х 5) равных квадратов. Как только
животное вступало на новый квадрат обеими передними лапами, это
регистрировалось как горизонтальное движение. У крыс в течении 3 минут
регистрировали горизонтальную (число пересеченных квадратов), вертикальную
(число «стоек») и исследовательскую (число заглядываний в «норки») активность
[168].
О когнитивном дефиците экспериментальных животных судили по их способности к
обучению и запоминанию аверсивного стимула в тесте УРПИ [168].
Выраженность неврологического дефицита определяли по шкале McGrow [169].
Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов: до 3 баллов –
лёгкая степень, от 3 до 7 баллов – средняя степень и от 7 баллов и выше –
тяжёлая степень. Отмечали парезы, параличи конечностей, тремор, манежные
движения, птоз, положение на боку, подвижность, также как проявление
неврологического дефицита рассматривали удерживание крыс на вращающемся стержне
диаметром 15 см со скоростью вращения 3 об/мин. Животных тестировали ежедневно,
выставляя сумму баллов.
Статистическую обработку данных проводили с использованием параме
- Київ+380960830922