РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Роботу виконано у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і
штамів мікроорганізмів Державного департаменту ветеринарної медицини МАП
України з 1997 по 2007 р.
2.1. Штами виробничі та епізоотичні
У дослідженнях використовували 3 виробничі штами сальмонел і 19 – пастерел,
отримані з колекції Національного центру штамів мікроорганізмів, 17
епізоотичних штамів сальмонел, виділених з патологічного матеріалу від хворих
та загиблих тварин різних видів (телята, поросята, ягнята, птиця) у
тваринницьких господарствах Запорізької та Херсонської областей України; штами
лістерій – отримані з Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.
Громашевського (АМН України), Інституту мікробіології та імунології ім. І. І.
Мєчнікова (АМН України), Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної
медицини (ІЕКВМ), Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини.
. Поживні середовища
При виконанні роботи для культивування бактерій використовували такі поживні
середовища:
поживний м’ясо-пептонний бульйон (МПБ) для культивування мікроорганізмів
(сухий);
м’ясо-пептонний агар (МПА) для культивування мікроорганізмів;
середовище Олькеніцького для виявлення культур, гідролізуючих сечовину;
поживні середовища для визначення біохімічних властивостей мікроорганізмів з
цукрами й багатоатомними спиртами (середовища Гісса): глюкоза, галактоза,
лактоза, маніт, цукроза, арабіноза, сорбіт, дульцит, ксилоза, рафіноза,
рамноза, маноза, мальтоза, інозит;
середовище Сімонса для визначення утилізації цитрату;
поживне середовище для виділення ентеробактерій сухе (ЕНДО агар);
середовище Вільсен-Блера (вісмут-сульфіт агар) – для визначення здатності
бактерій утворювати сірководень (H2S).
Виробник указаних вище середовищ – Державний експериментальний завод медичних
препаратів (Україна, Київ). Поживні середовища виготовляли з сухих за методами,
вказаними на етикетках [182, 183, 184].
бульйон та агар Хотінгера виготовляли за класичною методою [182]; Напіврідкий
агар для культивування мікроорганізмів виготовляється на основі МПБ і МПБ
Хотінгера з додаванням 0,7 % сухого агару;
фізіологічний розчин виготовляли за класичною методою (джерело вище);
печінкова вода, виготовлена за Розановим [182];
розчин глюкози 20% офіцінальний;
середовище 199 на розчині Хенкса для культур клітин, pН 7,2. Виробник –Інститут
поліоміеліта і вірусних енцефалітів РАМН, Москва;
сироватка кінська нормальна для бактеріологічних поживних середовищ, рідка,
виробник ЗАО “Біофарма”, Україна, м. Київ.
Збагачені середовища для культивування пастерел (середовище PL-5) готували за
такою методою: до готового бульйону ( напіврідкого агару, агару) Хотінгера
додавали 5 % кінської сироватки, інактивованої впродовж 30 хв. при температурі
45-50 0С, та 1 % глюкози. Середовища витримували 3 доби при температурі 37 0С
(контроль на стерильність). На вказаних середовищах пастерели культивували при
37 0С впродовж 24-48 годин [187, 188, 189, 190, 191].
Збагачені поживними речовинами середовища для культивування сальмонел
(середовище SC-5) готували за такою методою: до 100 ml готового МПБ (МПА)
додавали 18 ml середовища 199, 18 ml печінкової води, розчину глюкози 20% – 10
ml. Стерилізували в автоклаві в режимі 0,5 атм. 30 хв.
Середовище для накопичення біомаси лістерій № 29973 складається з екстракту
пекарських дріжджів (ЕПД), панкреатичного гідролізату казеїну (ПГК), літію
хлориду, натрію хлориду, цитрату амонійного заліза і в якості джерела азоту –
гідролізату кільки з вмістом амінного азоту 0,15-0,20 г/% при такому
співвідношенні компонентів, г/л:
ЕПД – 2,0;
ПГК – 10,0;
Літію хлорид – 15,0;
Натрію хлорид – 3,0;
Цитрат амонійного заліза – 0,5;
Панкреатичного гідролізату кільки – 15,0;
Дистильована вода – до 1 л.
Готують панкреатичний гідролізат кільки за Хотінгером відповідно до методики
[182]. До одного літра гідролізату кільки, який містить 15,0 г. сухого
панкреатичного гідролізату, додають наважки, кип’ятять до розчинення
компонентів. Після охолодження доводять рН до 7,2 – 7,4, фільтрують та
стерилізують за 0,5 атм. протягом 30 хвилин. Для приготування поживного
середовища беруть наступні наважки компонентів, г/л:
ЕПД – 2,0;
ПГК – 10,0;
Літію хлориду – 15,0;
Натрію хлориду – 3,0;
Цитрату амонійного заліза – 0,5;
Панкреатичного гідролізату кільки – 15,0.
Концентрацію іонів водню встановлювали pН – метром ЕБ – 74. Для підкислення
середовищ використовували 10% розчин KH2PO4, а для доведення pН в лужному
напрямку використовували 10% розчин Na2HPO4.
Для порівняння ростових властивостей різних середовищ використовували МПБ,
бульйон Хотінгера, середовище Мартена, МПБ з додаванням 1 % гідролізату казеїну
та 0,2 % ПГК.
З цією метою спочатку робили посів кожного тест-штаму на скошений МПА. Готували
у стерильному 0,9 % розчині хлориду натрію мікробну завись, яка за стандартом
каламутності відповідала 500 млн. м.к./см3.
Після цього робили засів кожної культури по 0,1 см3 на 6 см3 кожного рідкого
середовища: МПБ, МПБ з додаванням 1 % гідролізату казеїну і 0,2 % гідролізату
дріжджів, середовища Мартена та бульйону Хотінгера (3 пробірки). Інкубували 24
години за температури (35 ± 0,5) 0С. Далі готували з кожної пробірки кожного
рідкого середовища десятикратні розведення на стерильному фізіологічному
розчині до розведення 10-8.
З розведення 10-5–10-8 засівали по 0,1 см3 мікробної зависі на чашку Петрі з
МПА (n=6).
Посіви інкубували протягом 48 годин за температури (35 ± 0,5) 0С.
Колонії Listeria monocytogenes, Listeria ivanvii, Listeria inocua на МПА були
круглими, прозорими з сірувато-білим відтінком, розміром 0,2 – 1,0 мм.
Облік результа
- Київ+380960830922