РОЗДІЛ 2
об’єкт і МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження та експериментальна модель
Дослiдження проводили на білих нелінійних статевозрілих щурах-самцях з масою
тіла 150-200 г, яких утримували на стандартних світловому, харчовому та
температурному режимах віварію. В процесі виконання роботи використано 366
тварин.
В ході роботи було застосовано такі речовини та препарати: попередник синтезу
оксиду азоту L-аргініну гідрохлорид (“Sigma”, USA), неселективний блокатор
NO-синтаз – N-нітро-L-аргінін метиловий ефір (“Oldrich. Chem. Co.”, Англія),
селективний блокатор індуцибельної NO-синтази – аміногуанідин (ООО
„Химлабораторреактив”, Київ), кислота глутамінова (Фармацевтична компанія
“Здоров’я”, м. Харків), глутаргін (L-аргініну-L-глутамат – комплексний
препарат, до складу якого входить L-аргінін і кислота глутамінова)
(Фармацевтична компанія “Здоров’я”, м. Харків), триметазидин (“Servier
international”, Франція).
В якості експериментальної моделі було використано гостре адреналінове
пошкодження міокарда, яке спричиняли шляхом одноразового внутрішньоочеревинного
введення 0,18 % розчину адреналіну гідротартрату ("Дарниця", Україна) з
розрахунку 1 мг/кг [104]. Дослідження біохімічних показників проводили через
0,25 год, 1 год і 24 год розвитку АПМ (І, ІІ і ІІІ терміни дослідження), що
відповідає проявам гострої гіпоксії, початку та максимуму процесів
некрозоутворення [104].
Виведення піддослідних тварин з досліду проводили під наркозом, викликаним
тіопенталом натрію (внутрішньоочеревинне введення 1 % розчину, з розрахунку 50
мг на 1 кг маси тварини). Для дослідження використовували гомогенати міокарда
та сироватку крові.
L-аргінін вводили протягом 7 днів з розрахунку 25 мг/кг у вигляді 2,5 % водного
розчину [148], 4 % розчин глутаргіну – протягом 7 днів в дозі 45 мг/кг (в
еквімолярній дозі у перерахунку на L-аргінін), кислоту глутамінову – протягом 7
днів з розрахунку 20 мг/кг (в еквімолярній дозі у перерахунку на глутаргін),
L-NAМЕ – протягом 4-х днів у вигляді 1 % водного розчину із розрахунку 10 мг/кг
[178, 199], AГ – протягом 4-х днів у вигляді 1 % водного розчину із розрахунку
10 мг/кг [178], триметазидин – протягом 7 днів з розрахунку 25 мг/кг [5, 118].
Всі речовини вводили перед моделюванням експериментальної патології
внутрішньоочеревинно, один раз на добу. Контрольні групи тварин отримували
внутрішньоочеревинно відповідну кількість розчинника. При комбінованому
застосуванні глутаргіну і блокаторів синтезу оксиду азоту речовини вводили
внутрішньоочеревинно 1 раз на добу протягом 7 днів у дозах, аналогічних
описаним вище.
В процесі виконання дисертаційної роботи вивчали вплив вищевказаних речовин на
стан прооксидантно-антиоксидантної системи, активність ферментів мітохондрій і
маркерних ферментів цитолізу, рівень сечовини в сироватці крові, вміст
стабільного метаболіту NO – NO2– у серці і сироватці крові щурів при гострій
гіпоксії міокарда, спричиненій адреналіном. У тесті з плаванням [39]
встановлювали толерантність тварин до фізичного навантаження. Функціональний
стан серця досліджували за показниками ЕКГ.
Досліди на тваринах проводили відповідно до „Загальних етичних принципів
експериментів на тваринах”, ухвалених Першим національним конгресом з біоетики
(Київ, 2000) та узгоджених з положеннями „Європейської конвенції про захист
хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових
цілей” (European convention for the protection of vertebrate animals used for
experimental and other scientific purposes) (Страсбург, 1985) [57]. Комісією з
питань біоетики Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.
Горбачевського (протокол № 14 від 18 жовтня 2007 р.) порушень морально-етичних
норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.
Розподіл піддослідних тварин на серії в залежності від застосування
досліджуваної речовини та термінів експерименту представлений у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин на серії дослідів при адреналіновій міокардіодистрофії
Серія тварин
Кількість тварин
Тривалість АПМ
0,25 год
1 год
24 год
Тривалість профілактичного введення
7 днів
4 дні
7 днів
4 дні
7 днів
4 дні
Контроль
30
42
48
Контрольна патологія – АПМ
30
42
48
L-аргінін
Глутаргін
12
Глутамінова кислота
N-нітро-L-аргінін
Аміногуанідин
Глутаргін + N-нітро-L-аргінін
Глутаргін + Аміногуанідин
Предуктал
2.2. Визначення активності процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ)
2.2.1. Визначення вмісту гідропероксидів ліпідів (ГПЛ)
Принцип методу ґрунтується на здатності екстрагованих гептан-ізопропіловою
сумішшю ГПЛ інтенсивно поглинати світло при довжині хвилі л=232 нм [33].
До 0,2 мл 10 % гомогенату додавали 4 мл суміші гептан-ізопропанолу (1:1) і
струшували протягом 15 хв на лабораторному струшувачі АВ-30 с. Потім у пробірки
додавали по 1 мл розчину НСІ (рН=2,0) і по 2 мл гептану, інтенсивно струшували
і після відстоювання та розшарування суміші (через 30 хв) відбирали гептановий
шар і вимірювали його оптичну щільність на спектрофотометрі (дейтерієва лампа)
при довжині хвилі l=232 нм. Як контроль використовували пробу, яка містила 0,2
мл дистильованої води замість досліджуваного матеріалу. Розрахунок вмісту ГПЛ
проводили у відносних одиницях за формулою:
СГПЛ=Е ґV1/V2=Еґ20,
де Е – оптична щільність гептанового шару проби;
V1 – кінцевий об’єм гептанового екстракту (4 мл),
V2 – об’єм досліджуваного матеріалу (0,2 мл).
Вміст ГПЛ виражали в умовних одиницях екстинкції
- Київ+380960830922