РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методики дослідження культур дріжджів Saccharomyces cerevisiae
Дослідження проводилися на спиртових дріжджах Saccharomyces cerevisiae раси XII. Культури дріжджів отримані в Національному університеті харчових технологій. Клітини у діаметрі 10-20 мкм, закругленої форми, мають щільну целюлозну оболонку. Як джерело харчування дріжджі використовують різні вуглеводи. Розмноження клітин відбувалося брунькуванням, тобто асиметричним поділом. Після 3 - 4 брунькувань клітина гине. Період між поділами для даної раси дріжджів становив 1 годину 20 хвилин - 1 годину 50 хвилин залежно від умов середовища. Коли більшість клітин поділяється одночасно, культура вважається синхронізованою, а коли моменти поділу усіх клітин не корелюють -- несинхронізованою, або асинхронною. У біології поняття синхронізації клітин пов'язане з єдиним параметром -- фазою їхнього клітинного циклу, і не має на увазі ніяких інших коливань [92]. Синхронізація не може бути стовідсотковою внаслідок природної гетерогенності популяцій.
Біологічний матеріал являв собою суспензію дріжджових клітин з концентрацією 1.5 - 2.0 ? 108 клітин/см3. Вік культури клітин (час зростання у оптимальних умовах) до початку опромінювання становив 24-72 години. Ми помітили, що сприйнятливішими до дії ЕМВ були однодобові культури дріжджів. Під мікроскопом у них спостерігалося багато клітин, що брунькуються. До початку опромінювання суспензія дріжджових клітин охолоджувалася у термостаті при t = +(4-6)?C. Опромінювання суспензії проводилося у чашках Петрі діаметром 7 см. Об'єм зразків становив 7 см3. Контрольні зразки суспензії витримували в установці при вимкненому генераторі ЕМВ НВЧ. Після обробки усі зразки суспензії переносили до пробірок, охолоджували до t= +(4-6)?C та зберігали у термостаті. Суспензія клітин з кожної пробірки після перемішування засівалася по 5 см3 у стерильне поживне середовище - солодове сусло (100 см3). Зростання відбувалося у скляних колбах з ватно-марлевими пробками, у термостаті при t= +30?C, без аерації. За 20-24 години зростання культури колби виймали, суспензію перемішували, відбирали стерильною піпеткою проби, розводили дистильованою водою (5 см3 : 100 см3) і спостерігали під мікроскопом [119]. При цьому відмічали відхилення у середньому розмірі клітин (гігантськи, менші за норму), форму клітин (типові для даної раси округлі, видовжені або інші) та кількість клітин дріжджів, що брунькуються.
Концентрація визначалася підрахунком кількості клітин у 5 великих квадратах камери Горяєва. За даних умов вирощування концентрація дріжджових клітин у суспензії через 24 години становила ( у середньому): без аерації --1?2?108 клітин/см3; з аерацією--3?5?108 клітин/см3. Для зручності порівняння результати нормувалися на середнє значення контролю у кожній серії зразків, тобто визначалася відносна зміна кількості клітин [120, 121]. Таким чином, дія НВЧ-поля визначалася не на безпосередньо опромінюваних зразках культури дріжджів, а приблизно на двадцятому поколінні клітин.
Для визначення життєздатності культур дріжджів після НВЧ опромінювання використався метод підрахунку колоній [122]. Контрольні і експоновані по 5 хвилин зразки суспензії послідовно розводилися стерильним фізіологічним розчином (1 : 9), і проба з шостого розведення (~102 клітин/см3) висівалася на поверхню густого сусло-агару у чашці Петрі. Після інкубування у термостаті при +37?С протягом 24 годин підраховувалася загальна кількість колоній клітин у кожній чашці Петрі.
Для визначення кількості мертвих клітин у культурах зразки суспензії забарвлювали метиленовим синім [131]. В опромінених культурах спостерігалися значні відмінності у кількості мертвих дріжджових клітин у порівнянні з контролем.
Як допоміжні методи для оцінки інтенсивності бродіння використовувалися: визначення кількості (маси) вуглекислого газу, який виділився клітинами дріжджів, визначення залишку (відсотку) сухих речовин у культуральній рідині після бродіння та поляриметричний метод визначення кількості цукру у поживному середовищі.
2.2. Водорості Dunaliella viridis, бактерії Escherichia coli як модель для вивчення відгуку мікроорганізмів на дію ЕМВ НВЧ у реальному часі
Для впевненого визначення біологічної дії ЕМВ НВЧ слід обирати як модель добре вивчені організми. Крім клітин дріжджів, класичним об'єктом для мікробіології та генетики є кишкова паличка Escherichia coli. Тому в перших експериментах з технікою міліметрового діапазону Н.П. Залюбовська, Р.Л. Віленська, А.З.Смолянська, С.Дж. Вебб вивчали вплив цього випромінювання на бактерії E. coli [8, 9, 30, 31, 91]. На зелених одноклітинних водоростях дослідники зосереджували увагу тому, що ці водорості є продуцентами білку та вітамінів [6, 100]. У результаті експериментів були виявлені зміни у біосинтезі, фотосинтезі, швидкості поділу, також спостерігався летальний вплив низькоінтенсивного ЕМВ НВЧ на бактерії. В усіх цих випадках вивчалася післядія ЕМВ НВЧ або біологічні зміни під час довготривалого (години, десятки годин) опромінювання культур клітин [7, 123].
Бактерії Escherichia coli відносяться до прокаріотних клітин, позбавлених ядра, а водорості Dunaliella viridis належать до еукаріотів, що мають ядро і є значно складніші за будовою. Вони виникли на різних етапах еволюції. Але ці мікроорганізми мають спільну ознаку -- здатність рухатися, розпізнаючи сигнали дії певних чинників. Така здатність реагувати на зміни у середовищі є дуже виразною біологічною реакцією, яка може оцінюватись за напрямом руху клітин та відносною величиною. Ми почали використовувати рухомі мікроорганізми -- бактерії Escherichia coli та зелені водорості Dunaliella viridis як модель для вивчення біологічної дії ЕМВ НВЧ на клітини у реальному часі.
Досліди проводилися з культурами галофільної одноклітинної зеленої водорості Dunaliella viridis Teod. штам 42. Зразки отримані в Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного.
Форма клітин Dunaliella viridis