РОЗДІЛ II
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єкти досліджень. Об'єктом досліджень були рослини:
- озимого жита (Secale cereale L., сорт Поліське тетра), озимої пшениці (Triticum aestivum L., сорт Миронівська 808), а також тканини плодів яблунь (Pyrus malus L.) cорту Кальвіль сніговий. Насіння озимого жита пророщували в термостаті при 24 ?С. Паростки довжиною 10-15 мм замочували у водних розчинах досліджуваних регуляторів протягом 15?30 хвилин і використовували для аналізу.
- хлорофілоносні листки рослин озимого жита (Secale sereale L., сорт Богуславка), квасолі (Phaseolus vulgaris L., сорт Лопата), помідорів (Licopersicon esculentum, сортів Київський (ранній строк дозрівання) і Донецький (пізній строк дозрівання), вирощених в польових умовах.
- хвоя ялини європейської (Picea abies [L.] Kersten) і ялини срібної (Picea pungens Engelm.).
Препарати, використані в роботі. В работі використали препарати (рис. 2.1) кампозан М (етефон) фірми Біттерфельд (Bitterfield, DDR), дігідрел виробництва Волгоградського заводу хімпрепаратів, хлористий холін, ацетилхолін (HCl і HJ солі) виробництва російського заводу "Мосмедпрепараты", 2-хлоретилтриметиламмоній хлорид (ССС) виробництва російських заводів, АБК (Abscisin II), гіберелін, ІОК, 2,4-Д, Tris.HCl і Tris фірми "Serva", дікват - фірми "Renal", тордон - фірми "DowElanco (USA)". Пластинки для тонкошарової хроматографії фірми "Сhemapol ".
Рис.2.1. Структурні формули препаратів етефону, етилену, піклораму, (+),S-АБК, діквату, зеатину, ІОК, 2,4-Д, гліфосату, і ГК3, використаних в роботі.
Визначення етилену. Етилен визначали газовими хроматографами "Selmihrom" і "Хроматограф-504". При визначенні на "Хроматографі-504" колонку із скла довжиною 1 м заповнювали Поропаком?Т, температура колонки 70?С, температура детектора 100?С, температура випаровувача 150?С. Витрати водню ? 40 мл/хв., азоту ? 40 мл/хв. і повітря ? 300 мл/хв. При визначенні на хроматографі "Selmihrom" (Суми) із полум'яно іонізаційним детектором і комп'ютером. Стальну колонку довжиною 2 м і діаметром 3.2 мм заповнювали Поропаком-Q (Poropack-Q, 80-100 mesh). Температура термостата 70?C, потоки N2, H2 і O2 (повітря) були 33, 33 і 350 мл хв.-1, відповідно. Ідентифікація етилену здійснювалась порівнянням з часом утримання стандарту.
Хвою ялини європейської (Picea abies [L.] Kersten) і ялини срібної (Picea pungens Engelm.) за 6 год перед поміщенням у флакони для акумуляції етилену обробляли газом SO2 100 ?л/л (протягом 30 хв.), або обприскували розчином тордону 1.10-4 M. Флакони після кожного визначення етилену продували повітрям.
Визначення АБК. Вміст АБК визначали методом газорідинної хроматографії. Заморожені і розтерті в рідкому азоті 2 г рослинного матеріалу екстрагували метиловим (етиловим) спиртом 2 рази протягом 1 год. Третю екстракцію проводили протягом ночі при 4?С в холодильнику. Екстракти зливали через скляний фільтр, об'єднували і випаровували під вакуумом. АБК очищали на силікагелевих пластинках "Silufol UV-254". Як розчинник використали систему хлороформ:етилацетат:оцтова кислота (75:20:5). Із відповідних зон АБК разом із силікагелем видаляли і розчиняли в метиловому спирті. Метилові ефіри АБК отримували за допомогою діазометану [36], які і ідентифікували на хроматографі "Цвет-106" з детектором електронного захоплення [15]. Температура детектора і випарювача - 230?С, термостата колонки - 200?С. Швидкість газу-носія азоту 40 мл/хв. Скляна колонка довжиною 2 м, діаметром - 3 мм наповнена Chromaton-N-super і просочена 3% OV-225.
Для визначення АБК методом тонкошарової хроматографії і рідинної хроматографії високого тиску в модифікації Савинського із співавт. ?94?, 3 г рослинного матеріалу фіксували рідким азотом і розтирали в ступці. Екстракцію проводили тричі 80%-ним етиловим (метиловим) спиртом (на 1 г брали 20 мл розчину) протягом 2 год і центрифугували при 3000 g, випаровували під вакуумом на ротаційному випаровувачі при температурі 40-45?С. Залишок розчиняли в 1 мл 96%-ного спирту, центрифугували і очищали на пластинках "Silufol" (UV-254): I - хроматографія в хлороформі (вимивання пігментів), ІІ - хроматографія в 12,5%-ному водному аміаку, ІІІ - хроматографія в системі розчинів етилацетат:оцтова кислота (20:1). На пластинку наносили 400 мкл розчину на полосу широною 2 см і промивали в хлороформі. Верхню частину пластинки із пігментами відрізали. Пластинку повертали на 180? і хроматографували в 2,5%-ному водному аміаку до підйому розчину вище 2-3 см стартової плями. Нижню частину відрізали на відстані 1 см вище стартової плями і відкидали. На краї пластинки наносили стандарти АБК і проявляли в системі розчинів: етилацетат:оцтова кислота (20:1). Із висушених пластинок із відповідних зон АБК екстрагували етилацетатом.
Для скануючої хроматографії екстраговану АБК розчиняли в 20-30 мкл етилацетату і розділяли на пластинках з оксидом кремнію ("Merk" Art 5715, F254) в системі розчинів хлороформ:етилацетат:оцтова кислота (100:100:1) і сканували на спектрофотометрі Camag TLC Scanner (Швейцарія).
Для рідинної хроматографії високого тиску екстраговану АБК розчиняли в 40 мл рухомої фази (ВЕРХ) на колонці розміром 3,3х150 мм, заповненій обернено-фазним сорбентом Separon SGX C18. В колонку вносили 10 мкл проби. Рухома фаза складалась із 50%-ного метанолу і 0,25%-ої оцтової кислоти. Швидкість витоку 0,5 мл/хв. Кількісну оцінку речовин проводили при 254 нм (чутливість 4).
Визначення ліпідів і жирних кислот. Ліпіди із мембран клітин виділяли як описано в [227, 410]. Хроматографію ліпідів здійснювали по [5, 79, 625, 626]. Жирні кислоти визначали методом газорідинної хроматографії [96].
Препарати мембран отримували із мікросомальної фракції розділенням її в градієнті густини сахарози [410]. Всі маніпуляції проводили при 0 - ?2?С. Паростки 2,0 г сирої маси подрібнювали і розтирали в ступці в розчині, що складався із 0.25 М сахарози, 3 мМ EDTA і 25 мМ Tris рН 7.7. На 1 г сирої маси