ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Общая характеристика исследованного материала. Исследования проводили на биоптатах дёсен практически здоровых людей (26 препаратов) и больных гингивитом, в анамнезе которых отмечалась язвенная болезнь пилорического отдела желудка (40 препаратов).
Забор материала (биоптаты межзубных десневых сосочков) осуществляли под проводниковой анестезией по ортодонтическим, ортопедическим показаниям и при безуспешном лечении периодонтита в хирургических отделениях стоматологических поликлиник г. Полтавы, а также на клинической базе кафедры хирургической стоматологии Украинской медицинской стоматологической академии. Материал фиксировали в 4 % растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере при рН 7,4, а затем - в 1% растворе четырех окиси осмия по Millonig [231]. После отмывки и дегидратации кусочки ткани пропитывали и заключали в эпон-812 по правилам, принятым в электронной микроскопии [232,233].
Исследования слизистой пилорического отдела желудка было проведено у людей, смерть которых наступила от случайных причин, при этом не было выявлено патоморфологических изменений характерных для хронического гастрита или язвенной болезни (11 препаратов).
Материалом исследования также служили прижизненно иссеченные ткани стенки пилорического отдела желудка людей, страдающих язвенной болезнью ( 21 препаратов). Одни из них (5 препаратов), получены при оперативных вмешательствах, показаниями для которых были желудочные кровотечения (І-я городская клиническая больница г. Полтава, 1996 г.). После иссечения препараты кратковременно промывали в физиологическом растворе и затем погружали в 12% раствор нейтрального формалина. После фиксации, отмывки и дегидратации кусочки тканей пилорического отдела желудка, содержащие краевые участки язвы, заключали в парафин. Полученные гистологические срезы окрашивали по общепринятым методам гематоксилином и эозином, а также по Ван-Гизон [234]. Эти срезы служили в целях общей оценки гистотопографических взаимоотношений между тканевыми структурами стенки пилорического отдела желудка, пораженной язвой.
Основное же содержание работы стало возможным благодаря тонким гистоцитологическим исследованиям препаратов слизистой оболочки пилорического отдела желудка, которые получены методом щипцовой биопсии при гастрофиброскопических исследованиях больных (4-я городская клиническая больница, г.Полтава, 1995) при этом 20 препаратов были взяты у больных, страдающих хронической язвой желудка.
После извлечения щипцов кусочки ткани слизистой оболочки тотчас же промывали в физиологическом растворе, после чего их помещали в 4% раствор глютарового альдегида на фосфатном буфере при pH 7,4.
Время фиксации биоптатов в растворе 4% глютарового альдегида с добавлением 1% раствора хлорида кальция составляло 60 минут. После предварительной фиксации препараты располагали на пластинке из органического стекла и в небольшом объеме свежего фиксатора разрезали на отдельные части. Потом их переносили во флакон со свежеприготовленным раствором 4% глютарового альдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) с добавлением хлористого кальция. Препараты помещали в холодильник на 12 часов при температуре 40С. После окончания фиксации кусочки ткани отмывали в фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением хлористого кальция (из расчета 0,65 мл 1% CaCl на каждые 2 мл буфера). Время промывания колебалось между 2 и 12 часами в 4-6 порциях свежего фосфатного буфера. Образцы тканей дополнительно фиксировали в осмиевом фиксаторе при температуре 40С в течение 2-х часов. Осмированные тканевые блоки отмывали в 0,1% молярном растворе фосфатного буфера (pH 7,4) в течение 1 часа (4 свежих порции по 15 минут в каждой). Подготовка тканевых блоков для последующего пропитывания в водонерастворимых эпоксидных смолах состояла в проведении их через спирты возрастающей крепости с постепенным переходом к ацетону (по схеме: 500 - 3 свежие порции по 10 минут; 700 - 3 свежие порции по 10 минут; 800 - 3 свежие порции по 10 минут; 950 - 3 свежие порции по 10 минут; 100% ацетон - 950 спирт 1:1 в течение 15 минут; 100% ацетон - 3 свежие порции по 15 минут ).
После дегидратации проводили пропитывание тканевых блоков в рабочей смеси смолы по несколько измененной схеме:
100% ацетон - полная смесь смолы 2:1 30 минут
100% ацетон - полная смесь смолы 1:2 30 минут
Полимеризация осуществлялась в термостате при температуре 370 С - 24 часа, 450 С - 24 часа, 580 С - 24 часа.
2.2. Подготовка образцов для исследования в световом микроскопе. Серийные гистотопографические срезы получали из тканевых блоков, залитых в парафин, а из блоков, залитых в эпоксидную смолу Эпон-812, изготавливали серии полутонких срезов, количество которых колебалось от 60 до 400. Широкое использование в работе серийных полутонких срезов побудило приспособить для их получения ротационный микротом МПС-2, который оснащен специально сконструированной приставкой, позволяющей надежно фиксировать в микротоме стеклянные ножи. При наклеивании полутонких срезов на предметные стекла использовали методику Апати [235], которая позволяет надежно фиксировать срезы и уменьшает их потери.
Для соблюдения последовательности расположения серийных полутонких срезов на предметных стеклах использовали принцип трафаретной раскладки. После получения необходимого количества срезов предметные стёкла размещали в термостате для высыхания на 12 часов при температуре 50 - 600С.
В качестве красителя использовали свежеприготовленный и отфильтрованный 0,1% раствор толуидинового синего на фосфатном буфере (pH 7,4).
Следующий этап заключался в получении микрофотоснимков (с помощью микрофотонасадки МФН - 12) и позитивных отпечатков с них при пятикратном увеличении фотоувеличителя с целью изготовления двухмерных фотор