Теоретический анализ таутомерного состава и таутомерных превращений оснований нуклеиновых кислот методами оптической спектроскопии

2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ....................................................... 6
Глава 1. Прототропная таутомерия оснований нуклеиновых кислот (обзор).................................................. 13
1.1. Явление таутомерии. Свойства и применение пуриновых и пиримидиновых оснований........................... 13
1.2. Спектральное и квантово-химическое исследование таутомерии оснований нуклеиновых кислот................. 21
1.2.1. Инфракрасная спектроскопия...................... 22
1.2.2. Электронные и электронно-колебательные спектры.
Структура электронно-возбуждённых состояний ... 33
1.2.3. Спектроскопия высокого временного разрешения 39
1.2.4. Основные признаки таутомерии.................... 42
1.3. Электронные и колебательные спектры комплементарных пар в разных фазовых состояниях..................... 51
1.4. Исследование взаимодействия оснований нуклеиновых кислот с водой.......................................... 52
1.5. Проблемы и задачи спектрального и квантовохимического исследования таутомерии оснований нуклеиновых кислот......................................... 54
Глава 2. Методика расчета колебательных спектров молекулярных соединений в разных фазовых состояниях.................... 56
2.1.11олуэмпирические методы расчёта (ЭП' и ВС) колебательных спектров многоатомных молекул.................... 57
2.2. Расчёт частот колебаний и интенсивностей полос в ИК
спектре изолированного урацила....................... 63
3
2.3. Интерпретация ИК спектра поглощения изолированного урацила с учетом множественных резонансов Ферми 66
2.4. Расчёт частот колебаний и интенсивностей полос ИК и КР спектров поликристаллического аденина-ЫуН (приближение (ВЗРУР)......................................... 76
2.5. Расчёт спектров КР поликристаллического аденина-
Ы9Н и его дейтсрозамещённых в ВО приближении 86
2.6. Расчет частот и интенсивностей ИК и КР спектров 2,4-дикетонной формы урацила в конденсированных и изолированном состояниях (ВО приближение)........ 95
2.7. Выводы .......................................... 112
Глава 3. Влияние водородных связей на колебательные спектры оснований нуклеиновых кислот и комплементарных нар............ 114
3.1. Влияние водородных связей на ИК спектры тимина и NI ,Ыз-дейтеротим и на в твердом состоянии и водном растворе........................................ 114
3.2. Исследование влияния водородных связей на ИК
спектры цитозина в твёрдой и жидкой фазах.......... 124
3.3. Влияние водородной связи на структуру и колебательные спектры комплементарной пары аденин-урацил в изолированном состоянии................................. 130
3.4. Влияние водородной связи на структуру и колебательные спектры комплементарных пар аденин-тимин, гуанин-цитозин, аденин-урацил в конденсированных состояниях............................................. 139
3.5. Выводы........................................... 149
4
Глава 4. Определение таутомерного состава молекулярных соединений в разных фазовых состояниях по колебательным спектрам ...................................................... 152
4.1. Определение гаутомерных форм изолированного цитозина по ИК спектрам.............................. 152
4.2. Проготропная таутомерия имидазольного кольца пуриновых оснований нуклеиновых кислот............. 160
4.2.1. Расчёт частот колебаний и интенсивностей в ИК и КР спектрах пурина (Риг-Ы7Н, Риг-Ы9Н) и его дейтерозаме-щённых в разных фазовых состояниях....................... 161
4.2.2. Расчёт распределения интенсивностей в спектрах РКР пурина (водный раствор).................................. 169
4.3. Определение таутомерного состава пурина и аденина в изолированном состоянии.................................. 171
4.4. О механизме таутомерного превращения в имидазоле ... 180
4.5. Определение гаутомерных форм гуанина в конденсированных состояниях ........................................ 188
4.5.1. Расчёт частот колебаний и интенсивностей полос спектра КР гуанина в поликристаллическом состоянии 188
4.5.2. Спектры КР и структура гуанина в водном растворе
при разных pH....................................... 193
4.6. Выводы.............................................. 197
Глава 5. Исследование таутомерии по электронно-возбуждённым состояниям..................................................... 199
5.1. Структура аденина, пурина, урацила, тимииа в п-я и
л-тг* возбуждённых электронных состояниях............. 202
5.2. Определение гаутомерных форм пурина и аденина по электронно-колебательным спектрам......................... 207
5
5.3. Расчёт и анализ электронно-колебательных спектров пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот (урадила, тимина и цитозина) в разных фазовых состояниях — 216
5.4. Исследование таутомерии имидазола................ 230
5.5. Исследование таутомерии урацила при электронном возбуждении........................................... 237
5.6. Выводы........................................... 247
Глава 6. Полуэмпирический метод расчёта параметров таутомерного равновесия молекулярный соединений.................... 249
6.1. Определение параметров таутомерного равновесия и стабильности.......................................... 250
6.2. Лактам-лактимная таутомерия урацила, тимина и их тиозамещённых......................................... 253
6.3. Амино-иминная таутомерия......................... 263
6.4. Определение таутомерных структур тиозамещённых урацила методами ИК и РКР спектроскопии............... 271
6.5. Выводы........................................... 284
Глава 7. Анализ таутомерного равновесия и механизма переноса протона в воде........................................... 286
7.1. Квантово-химический анализ таутомерного равновесия
в воде............................................ 286
7.2. Анализ пикосекундных спектров флуоресценции таутомеров тимина и 5-хлорурацила..................... 299
7.3. Выводы 313
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫ ВОДЫ......................... 315
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.............................. 318
ПРИЛОЖЕНИЕ............................................ 354
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Многообразие проявлений таутомерии и необходимость учёта этого явления в практических приложениях ставит задачу сё изучения и связанную с ней разработку методов анализа таутомерного состава в разряд актуальных. Особый интерес представляет изучение прототроп-ной таутомерии биологически активных соединений, например оснований нуклеиновых кислот (ОИК), что является важной задачей не только структурной химии и спектроскопии, но и молекулярной биологии, рассматривающей, в частности, спонтанное возникновение мутаций как результат существования ОНК в различных гау томерных формах.
Таутомерия молекулярных соединений исследуется различными экспериментальными и теоретическими методами, среди которых наиболее распространенными, являются методы колебательной спектроскопии и квантовой химии. При этом определение таутомерного состава вещества и идентификация таутомеров спектральными методами часто вызывают серьезные затруднения. Например, наложение спектров нескольких таутомерных форм значительно усложняет их интерпретацию, особенно в конденсированных состояниях. Недостаточная информативность экспериментальных спектров приводит к неоднозначности результатов но определению таутомерных структур. Один из возможных способов решения этой проблемы заключается в предварительной теоретической оценке таутомерного состава вещества теми или иными методами. Проблема анализа (и предсказания) таутомерного состава молекулярных соединений усложняется при учёте различных механизмов таутомерных превращений - внутри- и межмолекуляриых.
Не в полной мере для определения таутомерного состава используются методы электронной спектроскопии, а также спектры РКР и высокого временного разрешения, позволяющие не только определять присутствие малого количества вещества, но и проводить анализ динамики переноса протона.
7
В связи с этим возникает задача развития уже имеющихся методов и поиска альтернативных подходов, позволяющих получать надёжные оценки таутомсрного состава молекулярных соединений и анализировать механизмы таутомерных превращений.
Целью диссертационной работы является развитие оптических методов определения таутомерного состава молекулярных соединений в разных фазовых состояниях и комплексное исследование прототропной таутомерии ОНК методами теоретической спектроскопии.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
1. Развить методику расчёта колебательных спектров как совокупность методов и приёмов, позволяющих достоверно определять таутомерный состав молекулярных соединений в разных фазовых состояниях.
2. Развить методику определения таутомсрного состава вещества по электронно-колебательным спектрам с учётом специфики проявления в них таутомерии.
3. Разработать полуэмпирический метод предсказания таутомсрного состава вещества с учётом механизма переноса протона и структурных изменений в молекуле.
4. Оценить влияние водородных связей на колебательные и электронные спектры ОНК и комплементарных пар в разных фазовых состояниях.
5. На примере имидазола исследовать проявление внутримолекулярного механизма переноса протона в ОНК методами колебательной (ИК, КР и РКР) и электронной спектроскопии.
6. Установить особенности таутомерного равновесия комплементарных пар в водном растворе в зависимости от температуры и кислотно-основных свойств ОНК.
7. Выяснить возможность установления механизма переноса протона в ОНК при разных значениях pH по спектрам флуоресценции с высоким
8
временным разрешением (на примере тимина (Thy) и 5-хлорурацила (5C1-Ura)).
Научная новизна работы определяется оригинальностью подхода, основанного на использовании современных оптических методов в исследованиях прототропной таутомерии молекулярных соединений, определения таутомерного состава и механизма переноса протона.
1. Предложена оптимальная и эффективная методика расчёта колебательных спектров молекулярных соединений в конденсированных состояниях, позволяющая определять таутомерный состав вещества и анализировать влияние водородных связей на колебательные и электронные спектры молекулярных соединений.
2. Установлены особенности и предложена методика определения таутомерного состава вещества в электронно-возбуждённых состояниях.
3. Предложена новая методика прогнозирования таутомерного состава вещества по спектрам на основе полуэмиирического метода расчёта параметра таутомерного равновесия с учётом внутри- и межмолекулярного механизма переноса протона.
4. Предложен метод расчёта относительных констант диссоциации ОНК в водном растворе и их температурная зависимость от рП в интервале от О до 50 °С. Вычисленные значения относительных констант кислотности и основности позволили дать общую характеристику влияния водного растворителя на таутомерное равновесие ОНК.
5. Определены спектральные проявления внутримолекулярного переноса протона в имидазоле с привлечением методов колебательной (ИК, КР, РКР) и электронной спектроскопии.
6. Установлено, что механизм переноса протона в димерах Thy и 5C1-Ura при разных pH'носит цвиттер-ионный характер.
7. Установлено влияние водородных связей на колебательные спектры комплементарных пар в зависимости от их структурного образования по
9
Уотсону-Крику и Хугстину.
8. Дана полная интерпретация: а) полного ИК спектра изолированного ига в ангармоническом приближении с учётом множественных резонансов Ферми; б) полных колебательных (ИК и КР) спектров
поликристаллического аденина-Ы9Н (Ас1е-Ы9Н) на основе модели тетрамера.
Практическая значимость работы определяется обшим характером развитых в ней методик оптического определения таутомеров в разных фазовых состояниях. Эти методики могут быть использованы при исследовании таутомерных свойств широкого класса молекулярных соединений: гетероциклических структур, ОНК в водных растворах и т.д.
Разработанный в работе полуэмпирический метод расчёта параметров таутомерного равновесия и относительных констант диссоциации на моно-молекулярном уровне может быть использован для прогнозирования таутомерного состава и кислотно-щелочных свойств сопряжённых таутомерных структур, что важно на практике при создании наносистем заданного назначения.
Полученные результаты внедрены в учебный процесс на кафедре прикладной оптики и спектроскопии СГУ:
• используются в виде материала, используемого при чтении специальных курсов лекций «Квантовая биохимия», «Молекулярные спектры и химические превращения», «Спектроскопия оснований нуклеиновых кислот»;
• изложены в учебных пособиях:
- Тен Т.Н., Нечаев В.В., Бабаян В.И., Березин В.И. (1997) Квантовохимическая теория строения и скоростей химических реакций. Саратов: Изд-во СГУ, 58 с.
10
- Тен Т.Н., Бурова Т.Г., Баранов В.И. (2004) Спектроскопическое исследование структуры оснований нуклеиновых кислот. Саратов: Изд-во «Научная книга», 149 с.
- Тен Т.Н., Бурова Т.Г., Баранов В.И. (2008) Квантово-химическое исследование прототроп ной таутомерии оснований нуклеиновых кислот. Саратов: Изд-во «Научная книга», 157 с.
Связь с государственными программами. Работа была поддержана грантами Президента РФ № НШ-1186.2003.3 и № НШ-5203.2006.3.
Достоверность результатов диссертации. Достоверность полученных результатов и выводов обеспечивается адекватностью используемых физических моделей и квантово-механических вычислительных методов, корректностью используемых приближений, а также количественным и качественным соответствием полученных в работе теоретических результатов экспериментальным данным и данным других авторов. V
Основные положения и результаты, выносимые на защиту.
1. Предложенная методика моделирования колебательных спектров тауто-меров позволяет определять таутомерный состав вещества в разных фазовых состояниях. Методика основана на решении прямой колебательной задачи (механической, электрооптичсской, ангармонической), использующей ЮРТ-приближсние для изолированной молекулы, и применении результатов этого расчёта для решения обратных спектральных задач в валентно-оптическом (ВО) приближении для конденсированных состояний с изменением в силовом и электрооптическом полях изолированной молекулы параметров структурного фрагмента, принимающего непосредственное участие в образовании водородной связи.
2. Предложенная методика определения изменений таутомерного состава вещества в электронно-возбуждённых состояниях позволяет исследовать механизм'таутомерных превращений и определять таутомериые формы, образующиеся в результате электронного возбуждения. Методика основа-
11
на на построении структурно-динамических моделей в комбинирующих электронных состояниях, расчёте электронно-колебательных спектров, определения таутомерного состава по вибронной структуре электронных спектров и сравнительного анализа таутомерного состава в основном и электронно-возбуждённых состояниях. Установлено, что анализ таутомерного состава для пиримидиновых ОНК возможен, начиная с первого возбуждённого состояния, а для пуриновых - со второго.
3. Разработанный полуэмпирический метод расчёта параметра таутомерного равновесия с учётом внутри- и межмолекулярного механизма переноса протона и структурных изменений в молекуле позволяет прогнозировать спектры и таутомерный состав вещества.
4. Механизм переноса протона в димерах 5-замещённых урацила и комплементарных пар в разных фазовых состояниях носит цвипер-ионный характер. Протолигичсское равновесие является одной из причин образования комплементарных пар как канонических, так и редких таутомерных форм ОНК.
5. Структурно-динамические модели таугомеров (всего 61) и таутомерный состав ОНК в разных фазовых и электронных состояниях. Модели обоснованы расчётом спектральных свойств веществ и находятся в полном согласии с экспериментальными данными.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих конференциях: II, III, IV Саратовская межвузовская конференция «Спектроскопия и физика молекул. Проблемы преподавания физики» (Саратов, 1997-1999); 1, 2, 3, 4, 5 и 6 Всероссийские конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 1998-2007); XXIV European Congress on Molecular Spectroscopy (Czech. Republic, Prague, 1998); XXXI Colloquium Spectroscopy (Turkey, 1999); International Conference on Advanced Vibrational Spectroscopy (Finland, 2001); Международная молодёжная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике (Саратов, 2000,
12
2002); Proc. XVI International School-Seminar «Spectroscopy of molecules and crystals» (Sevastopol, Ukraine. 2003); II Российская школа-конференция «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2004); XXVII European Congress on Molecular spectroscopy (Krakow, Poland, 2004); III съезд фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики и медицины» (2007); European congress on molecular spectroscopy (Croatia, 2008): Proceedings of 21 International conference on Raman spectroscopy (London, Great Britain, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 77 работ, в том числе 34 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК, 3 учебных пособия, 38 статей в тематических сборниках, материалах и трудах научных конференций.
Личный вклад соискатели. Все основные результаты получены лично автором. Методы решения рассматриваемых в диссертации задач и анализ-полученных результатов, обсуждались с научным консультантом д.ф.-м.н., проф. Березиным В.И. Расчёты спектров РКР были выполнены совместно с д.ф.-м.н, проф. Буровой Т.Г.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, списка литературы и приложения. Она содержит 315 страниц основного текста, включая 22 таблицы и 55 рисунков. Список используемых литературных источников содержит 376 наименований. Объем приложения — 110 страниц.
13
Глава 1. Прототронная таутомерия оснований нуклеиновых кислот (обзор)
В данной'главе представлен обзор работ, посвящённых исследованию таутомерии основанийнуклеиновых кислот (ОНК) спектральными и квантово-химическими методами:. Вначале кратко: рассмотрено понятие явления таутомерии. Далее на конкретных примерах показана широкая область применения пуриновых и пиримидиновых ОНК и их производных (1.1). Анализируется состояние исследований таутомерии ОНК спектральными и кванто-во-химичсскими: методами, формулируются основные проблемы, возникающие при определении таутомерного состава вещества методами колебательной и электронной спектроскопии. Рассматриваются перспективы определения таутомерных форм с помощью расчёта и анализа электронноколебательных спектров, спектров РКР и оптических спектров* высокого * временного разрешения (1.2). Выясняются особенности внутри- и межмоле-кулярного механизма таутомерных превращений ОНК с переносом протона (1.3); а также рассматриваются-некоторые вопросы таутомерии комплементарных пар (1.4). Анализируется взаимодействие ОНК с водой (1.5). На ос-, новании проведенного анализа формулируется ряд важнейших проблем и задач спектрального и квантово-химического исследования ОНК (1.5), решению части из которых посвящены следующие главы.
1.1. Явление таутомерии. Свойства и применение пуриновых и пиримидиновых оснований
Как известно, молекулярно-структурная характеристика вещества определяет,. сколько и каких атомов входит в состав молекулы и как эти атомы расположены в. пространстве. В ходе химической реакции состав и взаиморасположение атомов в молекулах может меняться, что и наблюдается при
14
различных изомерных превращениях: структурных, геометрических, оптических и конформационных. Подробно вопросы изомерии обсуждаются в работах [1-7].
В случае структурной изомерии химические соединения отличаются друг от друга порядком присоединения атомов в молекуле и расположением одинарных, двойных и тройных связей между атомами. Явление, когда два (или более) структурных изомера быстро превращаются друг в друга и между ними устанавливается подвижное равновесие, называется таутомерией.
Большой вклад в развитие представлений о таутомерных превращениях внёс наш великий соотечественник Л.М. Бутлеров. В 1877 году Л.М. Бутлеров при действии серной кислоты на триметилкарбинол получил два изомерных диизобутилена, образование которых он объяснил допущением равновесия между двумя углеводородами, водой и соответствующими спиртами. В этой ранней работе Л.М. Бутлеров идет дальше современных ему представлений, предполагая, что такое равновесие между изомерными веществами может существовать и в отсутствии какого-либо реагента. «В этих случаях, -писал Л.М. Бутлеров, - в каждом исследовании, касающемся химического строения такого вещества, молекула его всегда может вести себя как совокупность двух или более изомерных форм. Ясно, что химические реакции такою вещества будут определяться то одним, то другим его химическим строением, в зависимости от реагента и условий опыта» [8].
Немецкий химик Р. Лаар в 1885 г. предложил использовать для характеристики подвижной изомерии термин «таутомерия», который применяется и в настоящее время (по-гречески “тауто” - тот же самый, “мерос” — часть). Простейшая таутомерия - прототропная, при которой взаимное превращение структурных изомеров обусловлено миграцией протона.
Прошло немало времени, но явление прототропной таутомерии до сих пор привлекает внимание и изучается как экспериментаторами, так и теоретиками, причём не только химиками, но и специалистами в области физики и
биологии. Такой интерес не случаен. Являясь одним из видов изомерии, про-тотропное таутомерное превращение очень широко распространено в мире молекул, а механизм переноса протона может рассматриваться как частный случай общего явления присоединения для многих химических реакций.
При исследовании прототропной таутомерии широко используют молекулярное моделирование. Например, до недавнего времени, т.е. до появления техники регистрации спектров высокого временного разрешения, экспериментальное исследование таутомерии вследствие высокой скорости протонных миграций (например, частота обратимых перегруппировок для малонового диальдегида составляет 6,3*1011 Гц [9]) было практически невозможно и, как следствие этого, исследование переноса протона проводилось только путём моделирования процесса.
о
а)
о
Рисунок 1.1. Молекулярные диаграммы канонических форм Ade (а),
Gua (б), lira (в), Thy (г) и Cyt (д)
Одними из наиболее важных прототропных систем с точки зрения исследования жизненных процессов являются ОНК, входящие в состав ДНК и РНК, - аденин (Ade), тимин (Thy), гуанин (Gua), цитозин (Cyt) и урацил
16
(Ura) (рис. 1.1), которые могут иметь несколько прототропных таутомсрных форм: Ura — 12 , Thy — 12, Ade —5, Cyt —5, Gua - 10.
В пиримидиновых и имидазольных кольцах ОНК могут происходить переносы протона со связанных атомов азота либо на свободные атомы азота, либо на атомы кислорода оксо-гругшы. Для пиримидиновых оснований это лактам<->лактимная (кето<->енольная) и амино<->иминная таутомерия, а для Adc и Gua, кроме этого, в имидазольном кольце может происходить про-тогропная миграция от одного эндоциклического атома азота к другому, т.е. N7H<->N9H. Как показали многочисленные экспериментальные работы, доля оснований в оксо- и аминоформах мри физиологических условиях составляет >99,99% [10]. Данный фактор является определяющим в механизме воспроизведения ДНК с каноническими комплементарными парами Ade-Thy и Gua-Cyt, так как одна из наиболее общепринятых теорий спонтанного возникновения мутаций основана на возможности существования редких таутомеров ОНК. Без преувеличения можно сказать, что это явилось основной причиной проявления особого внимания к таутомерии ОНК.
Таутомсры обладают разными физико-химическими свойствами, например, реакционной способностью. В качестве примера можно сопоставить поведение уридина и 1-(Р-А9-рибозил)-4-этоксидигидропиримидона-2 (модель редкой таутомерной 4-оксо-формы уридина) по отношению к нуклеофильным реагентам. Если уридин в нейтральной среде довольно инертен, то его аналог легко реагирует с самыми различными агентами и служит благодаря этому чрезвычайно полезным промежуточным продуктом при синтезе разнообразных аналогов иуклеозидов [11].
Далее приведены некоторые данные о физико- и биохимических свойствах пуриновых и пиримидиновых соединений, имидазола, а также тио- и галогензамещёниых Ura. Это позволяет увидеть, с одной стороны, изменчивость свойств при таутомерном превращении (например, амфотерность), а с другой, широту области применения этих соединений, в
17
другой, широту области применения этих соединений, в частности, при создании лекарственных препаратов (более подробно о применении ОНК, их компонентов и производных см. в обзоре [12], а о биологической активности - в работе [13]).
Пурин (Риг) — бесцветные кристаллы; хорошо растворяется в воде, температура плавления т. пл. 216-217 °С. Устойчив к нагреванию в водных растворах кислот и щелочей, а также действию окислителей (горячая HNO и др.); амфотсрен (рК- 2.39 и 9.93) [14].
Производные Pur широко распространены в природе и играют большую роль во многих биологических процессах. Важнейшие производные пурина - Ade, Gua, гипоксантии, кофеин, мочевая кислота; пуриновый фрагмент входит в состав некоторых антибиотиков. Pur и ряд его производных обладают противоопухолевой^ противовирусной и противоаллергической активностью.
Пуриновые алкалоиды широко распространены в растительном и животном мире [15]. Наиболее важные представители пуриновых алкалоидов - теобромин (3,7-диметилксантин) и теофиллин (1,3-диметилксантин). Теобромин представляет собой бесцветные кристаллы, плохо растворим в воде (1:700), этаноле, диэтиловом эфире, растворим в водных растворах щелочей и кислот, т. пл. 351 °С. Содержится главным образом в какао (в количестве 1,5-2%) и парагвайском чае. Теобромин оказывает стимулирующее влияние на сердечную деятельность, расширяет сосуды и мускулатуру бронхов, усиливает мочеотделение. Применяется при спазмах сосудов мозга, реже - при отёках сердечной и почечной этиологии. Теофиллин - бесцветные кристаллы, хорошо растворим в горячей воде (1:85), плохо — в холодной воде (1:180) и этаноле, растворим в водных растворах кислот, т. пл. 268 °С. Содержится в основном в парагвайском чае, кофе и растениях семейства сапиндовых. По фармакологическому действию теофиллин близок к теобромину, отличается более выраженным мочегонным
18
более выраженным мочегонным действием. Применяется как бронхолигичс-ское средство.
В последнее время появился целый ряд лекарственных препаратов, синтезированных на основе пурина, например, ацикловир (ациклический синтетический пуриновый нуклеозид, эффективно подавляющий размножение вирусов простого герпеса) или аллопуринол (уменьшает синтез мочевой кислоты в организме, избыток которой возникает в результате нарушения пуринового обмена и приводит к заболеванию подагрой).
Интенсивный поиск лекарственных препаратов на основе пуриновых соединений для генной терапии, в частности, для лечения острых нелимфоидных лейкозов у детей, связан с использованием различных таутомерных форм пурина, поскольку именно различные таутомеры пурина (таутомерия Ы7Н<-»^Н по имидазольному кольцу) играют определяющую роль в мутагенных процессах белковых образований и влияют на возникновение раковых опухолей. При этом основной способ воздействия новых аналогов пуриновых оснований на опухолевую клетку заключается в прекращении синтеза репликационной нити ДНК.
Пуриновые основания - природные производные пурина. Входят в качестве агликонов (неуглеводного компонента) в нуклеиновые кислоты, нук-леозиды, нуклеотиды, фрагменты коферментов, витаминов и др. Канонические пуриновые основания нуклеиновых кислот - Аёе и виа.
Канонические и минорные пуриновые основания могут быть получены препаративно из нуклеиновых кислот путем кислотного гидролиза и последовательного разделения. Основания, метилированные по экзоциклической аминогруппе и по атомам N гетероцикла, образуются ферментативно в составе полинуклеотидов и играют важную роль в регуляции репликации и транскрипции, в защите клеток от чужеродных ДИК и системы трансляции от действия антибиотиков и др.
19
Аденин и гуанин входят в состав всего живого. Ade - бесцветное кристаллическое вещество, растворимое в холодной воде и в спирте, но плохо растворимое во многих других органических растворителях, т. пл. 352-354 °С. Аденин устойчив к действию горячей щёлочи; будучи амфолитом, образует соли с кислотами и основаниями. Gua также является бесцветным кристаллическим веществом, не плавится до 350 °С. Его в больших количествах получают из рыбьей чешуи. Кристаллы Gua настолько красивы, что он мог бы использоваться в качестве искусственного жемчуга. Он не растворим в воде, спирте и большинстве органических растворителей, но легко растворим в кислотах и основаниях [16]. Как и Ade, Gua легко образует простые и комплексные соли, но при этом является значительно более слабым основанием.
Пиримидины -самые распространённые соединения семейства диази-нов; например, Ura входит в состав РНК, Thy - в ДНК, a Cyt - в оба типа нуклеиновых кислот.
Урацил представляет собой белый порошок или иглоподобные кристаллы; хорошо растворим в г орячей воде, является высокоплавким веществом (т. пл. >300 °С) [17].
Тимин (5-мет илу рицин) - белые кристаллы (пластинки или иглы), хорошо растворимые в горячей воде, плохо — в органических растворителях.
В Ura может происходить самопроизвольное замещение одного или сразу двух атомов кислорода серой с образованием тиопроизводных 2S-Ura, 4S-Ura и 2S,4S-Ura. Тиоурацилы являются биологически активными, они нашли широкое применение в медицине. На их основе созданы многие лекарственные препараты. Исследование 4S-Ura показало, что он является ингибитором усвоения йода в организме человека, ухудшает течение угревой сыпи, вызывает гипопластическую анемию, оказывает опасное действие на репродуктивную функцию [18].
20
Биологическая активность 5~галогенурацилов (5-XUra; X=CI, Br, F, 1) вызывает исключительный интерес в биохимии и фармакологии. Так, например, на основе 5-XUra были разработаны антибактериальные лекарственные препараты, a 5-FUra используется при создании противоопухолевых лекарств [19, 20]. Кроме того, 5-XUra используются в различного рода биологических исследованиях, а именно, при изучении механизмов ферментативных реакций или мутационных процессов [11]. Было выяснено, что замещение Ura или Thy в ДНК или РНК 5-галогензамещёнными нарушает процесс репликации ОНК.
Метилурацил. В настоящее время для лечения лучевых поражений кожи применяются антибиотики, кортикостероиды, фитогемаглютинины, облепиховое масло и др. Однако большинство из них оказалось эффективными только при поверхностных поражениях кожи. Было показано [Исмаги-лова А.Ф. и др., Башкирский ГМУ], что производные пиримидина, в частности метилурацил, повышают эффективность антибиотикотерапии. При профилактическом введении производных пиримидина в течение 7 дней до общего облучения повышается их терапевтическое действие, уменьшается выраженность экссудативного компонента, возрастает эпителизация ткани, снижаются сроки заживления ран, наблюдается репарагивная регенерация кожи при лучевых поражениях.
Имидазол. Хорошо растворим в воде; т. пл. 90 °С, температура кипения т. кип. 256 °С. Амфотерен — проявляет как кислотные (рК—14.52), так и основные свойства (р/0=6.95). Кольцо имидазола (1т) содержится во многих природных соединениях, например, в гистамине, гистидине, аилантоине и пилокарпине. С гистамином, продуктом декарбоксилирования жизненно важной аминокислоты гистидина, связано развитие аллергий, и поэтому он вызывает большой интерес как противоаллергическое лекарственное соединение. Аллантоин представляет собой конечный продукт азотного метаболизма некоторых животных; пилокарпин является алкалоидом имидазольпо-
21
го ряда. Большое количество нитроимидазолов применяют в качестве бакте-риостатиков. Ядро Im содержится в витамине [14,16].
Многие физико-химические свойства ОИК обусловлены их свойством образовывать водородные связи. Так, образование специфических водородных связей пуриновых оснований с пиримидиновыми в комплементарных участках цепей нуклеиновых кислот, как и межплоскостные взаимодействия между соседними основаниями в полинуклеотидной цепи, определяют формирование вторичной и третичной структур нуклеиновых кислот. В комплементарных участках помимо канонических пар пуриновых оснований с пиримидиновыми (Ade-Thy и Gua-Cyt) могут образовываться неканонические пары (Gua-Ade, Gua-Thy и др.). Последовательность пуриновых и пиримидиновых оснований в полинуклеотидной цепи определяет генетическую информацию, заключенную в ДНК, вирусных и матричных РНК.
Дезаминирование Ade в составе полинуклеотида (превращение в гипоксантин) меняет информационный смысл и приводит к точковой мутации. Дезаминирование Gua (превращение его в ксантин) в составе матричных полинуклеотидов приводит к блокированию репликации и транскрипции. Метилирование пуриновых оснований но N7 в составе матричных поленуклсо-тидов не сопровождается изменением генетического смысла основания.
Более подробно проблема таутомерии гетероциклических соединений и вопросы прототропной таутомерии ОНК рассмотрены в обзорах [14,21-24].
1.2. Спектральное и квантово-химическое исследование таутомерии ОНК
Остановимся на наиболее важных результатах исследований таутомерии ОНК различными спектральными и квантово-химическими методами. Обратим внимание на возникающие при этом вопросы и проблемы.
22
1.2.1. Инфракрасная спектроскопии
Экспериментальное исследование таутомерии пуриновых ОНК методом низкотемпературной ИК спектроскопии. Экспериментальное исследование структурных особенностей таутомеров ОНК методами колебательной спектроскопии, как и других молекулярных соединений, стаю возможным благодаря разработанному методу матричной изоляции или методу низкотемпературной ИК спектроскопии в матрице отвердевшего инертного газа [25]. Первоначально данный метод был успешно применён для анализа проявлений водородной связи. Твердый инертный газ (например, аргон) образует жесткую матрицу, в которой изолируются все формы ассоциации, существовавшие в момент конденсации. Особое достоинство этого метода состоит в том, что полосы поглощения образцов с Н-связью становятся узкими, т.е. исчезает проблема разделения перекрывающихся полос. В дальнейшем этот метод ИК спектроскопии высокого разрешения стал широко использоваться для интерпретации колебательных спектров изолированных молекул, в том числе и таутомеров [26]. Для этого степень молярного разбавления вещества инертным газом делают такой, чтобы исключить автоассоциацию молекул. Наиболее эффективен этот метод в сочетании с квантовохимическими расчётами.
Обычно при таутомерном превращении в изолирующей матрице проявляется большее число колебательных полос, чем это соответствовало бы одной молекуле. Анализ колебательных спектров при этом значительно усложняется. Для идентификации таутомеров рассматривают либо валентные колебания, либо низкочастотные деформационные колебания, специфическим образом характеризующие тот или иной таутомер. Например, для идентификации енольных и кетонных таутомерных форм определяется положение полос поглощения валентных колебаний карбонильных v(CO) и гидроксильных у(ОН) групп.
23
Гуанин. Рассмотрим результаты экспериментального исследования лактам-лактимной таутомерии нуклеозидного аналога 9-метилгуанина и изоцитозина (пиримидиновая часть гуанина представляет изоцитозин), проведённого методом ИК спектроскопии в изолирующей матрице [27]. Ставилась цель определения таутомерного состава.
Интерпретация спектров основывалась на анализе функциональногрупповых частот в области валентных колебаний и низкочастотном спектральном диапазоне. Были проанализированы положения и интенсивности характеристических частот колебаний ОН-, - и ЫН-групп, используемых при идентификации изомерных форм, связанных с переносом протона. В высокочастотной области спектров 9-метил гуан и на и изоцитозина наблюдается большее число полос поглощения, чем должно быть для оксоаминоструктур. Такая же картина характерна и для 4-оксо-6-метилпиримидина [27, 28], для которого показано существование лактам-лактимного равновесия в газовой фазе и низкотемпературных матрицах, а колебания с частотами 3575 и 3432 см’1 отнесены к валентным колебаниям у(ОН) и у(ЫН), соответственно. В области низкочастотных колебаний 9-метилгуанина также наблюдается увеличение числа полос поглощения.
Метод матричной изоляции позволяет жёстко фиксировать равновесные распределения молекулярных форм этих соединений, характерных для газовой фазы, и выполнить их идентификацию. По интенсивностям колебательных полос, характерных для каждой молекулярной формы с учетом их молярных коэффициентов поглощения, можно рассчитать константы лактам-лактимного (кето-енольного) равновесия, т.е. получить количественную информацию об относительном содержании таутомеров в равновесии.
Так, согласно [27], константы равновесия, полученные на основе измеренных пиковых интенсивностей = ЦОН)//(NN), равны: 9.7 (Ыг-метил-
цитозин), 4.6 (изоцитозин), 1.5 (^^Л^-тримстилгуанин), 1.3 (9-
24
метил гуанин). Как видим, доля гидрокси-форм существенно выше доли традиционных оксо-форм и коррелирует с рядом значений энергии стабилизации гидрокси- форм [28].
Необходимо отметить, что структурные особенности ОНК (наличие заместителей, внутримолекулярные взаимодействия, образование водородных связей и т.д.) сильно влияют на их кислотно-основные свойства и тау-томерное равновесие [14], поэтому обнаруженная способность изолированных молекул 9-мегилгуанина находиться в гидрокси- таутомерной форме не может быть прямо перенесена на нуклеиновые кислоты.
Лдепип и пурин. Более сложная ситуация возникает при изучении тау-томерных форм Ade или Pur, связанных с переносом атома водорода от N7M<-> NyH в имидазольном кольце. Действительно, если в случае оксо- и гидрокси-форм молекулярных соединений их идентификация возможна за счёт характеристических полос поглощения карбонильной и гидроксильной групп в ИК спектрах, то при определении N7H- и NyH- таутомерных форм Ade или Pur, возникают сложности и при интерпретации спектров, и при сопоставлении результатов расчета с экспериментом [29]. Экспериментальное исследование изолированной молекулы Ade показывает расщепление полос поглощения в области валентных колебаний v(NH) и образование дублетов с частотами 3564 и 3556, 3497 и 3488, 3447 и 3440 см"1. Такое расщепление может быть вызвано таутомерией изолированной молекулы Ade в имидазольном кольце [29]. Для доказательства этого эффекта были изучены низкотемпературные ИК спектры 9-метиладенииа и Pur. Оказалось, что в спектре 9-метиладенина имеются только две полосы поглощения (3557 и 3438 см’1), интерпретируемые как валентные колебания NH-связи аминогруппы [30], а в спектре Pur имеется расщепление полосы, соответствующей валентному колебанию NH-связи имидазольного кольца (3491 и 3480 см'1).
Одной из наиболее трудных задач, связанной со сложностью интерпре-
25
тации колебательных спектров, является определение иминной формы Ade.
Исследование пуриновых ОНК в разных фазовых состояниях. Относительное содержание различных таутомеров может существенно зависеть от влияния окружающей среды, в частности, от величины диэлектрической проницаемости (с) растворителя [31-36]. Экспериментально показано [37-39], что в твёрдом и жидком фазовых состояниях Gua находится преимущественно в оксо-аминной форме, равновесная доля других таутомеров не более 10'3. Однако в процессе метаболизма ОНК азотистые основания могут находиться в условиях, значительно отличающихся от обычных водных растворов. Известно, что внутри больших белковых молекул или нукленротеид-ных комплексов эффективное значение е~2 [27-29]. Поэтому можно предположить, что внутри полисомы или в комплексе Д11К+ДНК-полимераза значения с отличаются от их величин в водном растворе.
При интерпретации полос поглощения авторы работ [27-29] использовали дейтерозамещённые молекулы, изотопные сдвиги которых для характеристических колебаний остаются постоянными в ряду ОНК, изученных в идентичных условиях.
Кроме лактам-лактимного, для Gua не исключены и другие таутомер-ные превращения. Так, метод ЯМР, применённый для гуанозина, растворённого в диметилсульфоксидс, фиксирует присутствие протона при атоме N| [40-41]. Данные, полученные из УФ спектров поглощения Gua и N,N-диметиламино^анина [42], согласуются с величинами смещений полос поглощения деформационных колебаний группы NH2 в ИК спектре и указывают на присутствие амино-иминного равновесия с преобладанием доли амин-ных форм (для твёрдой фазы и раствора). Эти «разногласия» лишь подтверждают, что таутомерия Gua зависит от окружения и фазового состояния вещества.
При исследовании лактам-лактимной и N7HU-»N9H таутомерии были
26
проанализированы колебательные спектры изолированной молекулы Gua и гипоксантина [28]. Анализ интенсивностей колебательных полос подтвердил ранее сделанные выводы о лактам-лактимных таутомерных превращениях: для Gua около 50% молекул находится в гидрокси-форме, а для гипоксапти-иа доля гидрокси-форм составляет менее 5%. Эти выводы также согласуются с результатами квантово-химических расчётов [43,44], предсказывающими высокую стабильность гидрокси-форм Gua.
Результаты квантово-химических расчётов таутомерии пуриновых ОНК. Следуя экспериментальным данным [29], согласно которым Pur и Ade в изолированном состоянии существуют в таутомерных формах N9H и N7H в приблизительно равных пропорциях, авторы работы [30] провели полное теоретическое отнесение колебательного спектра, рассматривая его как суперпозицию спектров обоих таутомеров. Расчёты методом ab initio без использования поляризационных функций (HF/4-21G) дали хорошее согласие вычисленных и экспериментальных частот колебаний значениями для обоих таутомеров (разница в несколько процентов; интенсивности не рассматривались).
Более детально вопрос о таутомерных формях изолированных молекул Pur и Ade был рассмотрен в работах [45-48]. Исследовались экспериментальные ИК спектры Pur, Ade и 2-хлораденина в изолирующей аргоновой матрице и одновременно проводились расчёты частот и интенсивностей колебательных спектров таутомерных форм методом ab initio с использованием поляризационных функций (HF/6-31 G(d, р)). Согласно полученным результатам в изолирующей матрице доминирующей формой является НД-1-таутомер (для Ade - аминоформа). Недостатком этого анализа являлось то, что область, которая достаточно достоверно может быть интерпретирована этим методом, ограничивалась двумя диапазонами частот - областью валентных колебаний (~3000 см'1) и областью деформационных колебаний ô(N9H),
27
ö(N7H) (~300-700 см’1), в которой неплоское деформационное колебание ö(NH) имеет большую относительную интенсивность, легко идентифицируется и поэтому его можно достаточно точно интерпретировать как в эксперименте, так и в расчёте. Однако окончательные результаты теоретического анализа (по утверждению самих же авторов) таковы, что сделать однозначный вывод о том, существуют ли в изолирующей матрице обе таутомерные формы (N9H- или Ы7Н-) или же только один таутомер N9H-, нельзя.
Хорошо известно, что в разных фазовых состояниях меняется содержание таутомерных форм ОНК и, соответственно, меняется константа их равновесия. Так, например, для изолированной молекулы Gua согласно квантово-химическим расчётам М7Н-оксо форма несколько стабильнее N9H-0KCO таутомерной формы, которая, в свою очередь, стабильнее Н;М-гидрокси-формы [49]. В растворе таутомерное равновесие сдвинуто в сторону N9II-оксо-формы [49-51]. Надо иметь в виду, что расчёты разного базисного уровня могут давать противоречивые и даже прямо противоположные результаты. Например, анализ экспериментальных колебательных спектров Gua в изолирующей матрице показывает присутствие более чем трёх различных таутомеров [28,52,53]. В то же время расчёт методом DFT предсказывает, что наиболее стабильной является N7H-okco таутомерная форма Gua [49], а метод MP2/6-31G**, напротив, показывает, что наименьшей энергией обладает таутомер Gua-NyH; поэтому выводы о присутствии, или, по крайней мере, доминировании в изолированном состоянии Gua-NgH или Gua-N7H, носят противоречивый характер [50,54].
Относительно преимущественного существования той или иной тауго-мерной формы Pur и Ade в жидкой фазе также существуют разные мнения. Первоначальное предположение, высказанное в работе [55] о том, что в растворах и Pur, и Ade находятся как в N7H-, так и в Н;Н-таутомерной формах, в дальнейшем, на основании расчётов спектров РКР Pur, выполненных этими же авторами [56], изменилось в пользу преимущественного существования
28
І
М71І-таутомера. Кроме того, с одной стороны, из-за более высокого дипольного момента Ы7Н-таутомеры должны быть более стабильны в полярной среде [47], а с другой, - существует мнение о сопоставимых количествах обеих таутомерных форм Риг и Ade в растворе [53]. Значения дипольных моментов для таутомеров Ade-N9H, Ade-N7H и 9-мeтил-Ade, вычисленных методом 4-31G, равны, соответственно, 2.37, 7.52 и 2.57 Д. В связи со сложностью экспериментального определения дипольных моментов для таутомеров Ade, эти значения могут быть сравнены с динольными моментами схожих молекулярных структур - Риг (2.92 Д), гипоксантина (3.16 Д) и 9-н-бутиладенина (3.0 Д), подтверждающими тот факт, что дипольный момент Ade-N7H выше дипольного момента Ade-N9H, что и объясняет доминирование присутствия N7H-TayTOMepiioH формы в полярном растворителе. Было показано [30], что Ade-N9H стабильнее Ade-N7H на 10.6 ккал/моль; при этом изменение свободной энергии AF для Ade-N9H и Ade-N9H составляет 1.1 и 0.7 ккал/моль, соответственно. Содержание Ade-N7H по данным ЯМР составляет не более 15% в растворе DMSO при 37 °С и увеличивается до 22% в воде при 22 °С [57,58].
Анализ результатов исследования таутомерии пиримидиновых ОНК. Цитозин в изолированном состоянии, также как и Gua, может иметь несколько таутомерных форм, что находит своё отражение в увеличении числа колебательных полос. Авторы работы [27] определили в аргоновой матрице две таутомериые формы Cyt — гидрокси- и оксо-, что позднее было подтверждено результатами расчётов ИК спектров. Кроме того, присутствие этих форм было также доказано квантово-химическими расчётами [59,60].
Надо отметить, что ИК спектр Cyt очень сложен для интерпретации. Принадлежность полос поглощения к различным таутомерам была определена по увеличению (для гидрокси-) или уменьшению (для оксо-) их интенсивностей после УФ облучения [61,62]. Тем не менее, даже после этой интерпретации ИК спектр Cyt в изолирующей матрице имеет ряд не идентифи-
29
цированных полос. Было высказано предположение, что в изолированном состоянии С>Д может существовать не только в оксо- и гидрокси-формах, но и в иминной. Доказательство этого предположения затруднено из-за присутствия весьма малого количества этого таугомера Су1 в изолированном состоянии [61].
Константа таутомерного равновесия (гидрокси- и оксо-форм) Су1 была рассчитана как отношение интегральных интенсивностей К - Л**" (О//)/Л9МИ(#,//). При этом учитывалось, что коэффициенты поглощения полос ИК спектра, интерпретируемых как валентные колебания у(ОН) и у(ББН), либо равны, либо очень близки. Полученные значения К равны 2.74 и 2.89 для спектров в аргоновой и неоновой матрицах соответственно. Более точные значения констант равновесия могут быть получены, если принимать во внимание интегральные интенсивности всех полос, характеризующих данную таутомерную форму. В этом случае значения К уменьшаются до 1.84 и 1.88 в Лг и N0 матрице, соответственно. Учёт изменения свободной энергии ДБ уменьшает значение ЛГ до 1.7 (7=500 К), что согласуется с экспериментом [61].
Комплексное исследование колебательных спектров Су1 в разных фазовых состояниях проведено в работе [63]: были экспериментально изучены ИК и КР изолированного СуБ спектры нейтронного неупругого рассеяния в твёрдой фазе при температуре 15 К и выполнены квантово-химические расчеты спектров изолированного Су1 методом МР2. Как считают авторы этого исследования, сочетание перечисленных выше методов является мощной методологической основой для исследования колебательной динамики молекул. Расчёт показывает, что лактимная форма Су1 имеет более низкое значение минимальной энергии, чем лактамная. Принимая во внимание, что разность энергий невелика Д£ = 0.004 ккал/моль и, следовательно, оба таутомера могут находиться в газовой фазе, интерпретация колебательного спектра
30
сделана в предположении одновременного существования оксо- и двух гид-рокси-форм Cyt: гране- и цис-. Вычисленные квантово-химическим методом электронная энергия и вращательные постоянные таутомеров Cyt хорошо согласуются с экспериментом [63].
Заметим, что при расчёте частот нормальных колебаний Cyt были использованы масштабирующие множители, значения которых изменялись в пределах 0.82-г 1.22, за исключением валентных колебаний связей N|H и С20, для которых масштабирующие множители выбирались равными 0.62 и 0.79.
В полярном растворителе и твёрдом состоянии Cyt существует только в одной таутомерной форме, а именно лактамной [64-66].
Урацил - простейшее основание нуклеиновых кислот. Таутомерия Ura была изучена всеми существующими спектральными методами. Как показали результаты экспериментальных исследований »методом ЯМР [67], УФ [68-72], ИК, КР и микроволновой спектроскопии [73-76], наиболее стабильной является 2,4-диоксо таутомерная форма Ura, причём во всех трёх агрегатных состояниях. Согласно калориметрическим измерениям, 2-оксо-4-гидрокси таутомер Ura менее стабилен по сравнению с 2,4-диоксо таутомерной формой Ura (увеличение энергии составляет 79.5±25.1 кДж/моль) [77]. Всего существует 12 таутомерных форм Ura, относительная стабильность которых для изолированных состояний была определена разными квантовохимическими методами [78].
Каноническая форма Тимина (5-метилзамещённая молекула Ura) также является наиболее стабильной из всех 12 таутомерных форм, аналогичных Ura. Соответственно результаты экспериментального исследования таутомерии Thy аналогичны Ura [79-84]. Так, в колебательных спектрах, изученных методом матричной изоляции, отсутствует полоса поглощения, соответствующая валентному колебанию связи ОН, что подтверждает существование только одной 2.4-диоксо таутомерной формы Thy в изолированном
31
состоянии.
S-гало идозамещснные ур ацил а. Интерес к галоидозамещённым ОН К вызван не только той ролью, которую они играют в процессах мутаций нуклеиновых кислот, но и их применением при создании лекарственных препаратов, в частности, по лечению лейкемии. При этом спектры галоидозамещённых мало изучены по сравнение со спектрами Lira и Thy [85-87].
Наиболее полное исследование таутомерии проведено для 5-галоидозамещённых цитозина: 5F-Cyt, 5Br-Cyt и 5l-Cyt [88]. Из экспериментальных спектров путём измерения интенсивностей полос поглощения были определены константы таутомерного равновесия (гидрокси/оксо) для Cyt, 51-Cyt, 5-Br-Cyt и 5F-Cyt, значения которых равны 2.5, 8.4, 12.5 и 21.8 соответственно и они коррелируют с электроотрицательностыо галогенов 1, Br, 5F. Константы были определены из спектров, измеренных в газовой фазе при Г=500 К. Таким образом, для 5-галоидозамещённых Cyt характерно увеличение содержания гидрокси-форм по сравнению с Cyt в тех же экспериментальных условиях.
Тиозамещённые урацила. Теоретическое и экспериментальное исследование низкотемпературных спектров тиозамещёнпых Ura, а именно, 2S-Ura, 4S-Ura и их Nr, Ы3-метилзамещённых, а также 2,4S-Ura, показало, что все эти соединения существуют в газовой фазе только в оксотио или дитио-таутомерных формах [89,90].
Напротив, для 2S- и 48-метил замещённых Ura характерно наличие смеси как гидрокси-, так и оксогиотаутомсров. Используя интегральные интенсивности экспериментальных полос поглощения валентных колебаний связей NH и ОН, были вычислены константы таутомерного равновесия К (оксо/гидрокси), значения которых равны 1.5 и 0.5 для 2-метилтиоурацила и 4-метилтио-6-метилурацила [91].
Для таутомеров 2S,4S-Thy методом DFT были определены относительные стабильности и определены наиболее вероятные реакционные центры
32
присоединения атома водорода в водном растворе [92]. Из результатов расчёта следует, что наиболее стабильным в газовой фазе является сам 2S,4S-Thy.
Исследование таутомерии ОН К методом резонансного комбинационного рассеяния. Одним из достоинств спектров РКР является возможность исследования водных растворов, что позволяет изучать основания ДИК в естественной для них среде. Другим важным преимуществом метода РКР является его чувствительность к крайне малым количеством вещества вплоть до мономолекулярных слоев. Поэтому весьма удивительно, что этот метод не используется для идентификации таутомеров ОНК. Целесообразно выяснить, можно ли использовать метод РКР для определения тау том ерных форм ОНК, причём в тех случаях, когда равновесие незначительно смещено в сторону одного из таутомеров.
Подведём предварительный итог.
Применение методов колебательной спектроскопии для определения тау то мери ого состава вещества в разных фазовых состояниях имеет ряд сложностей, не позволяю!цих, в частности, считать вопрос определения тау-томерных форм ОНК полностью решенным [29,30,48,55,93]. Наблюдающиеся различия в теоретических и экспериментальных спектрах требуют дополнительного анализа и выяснения причин возникающих противоречий.
Можно выделить две основные проблемы.
Во-первых, это сложность интерпретации колебательных полос поглощения, обусловленная наложением спектров нескольких таутомерных форм, а также влиянием водородных связей на колебательные спектры в конденсированных состояниях.
Во-вторых, сильная зависимость результатов квантово-химических расчётов от выбранного базиса, связанная с весьма малой величиной потен-
33
циального барьера таутомерных структур. При этом разная точность методов расчёта может привести к прямо противоположным результатам.
1.2.2. Электронные и электронно-колебательные спектры.
Структура электронно-возбуждённых состояний
Теоретическое и экспериментальное исследование электронных спектров поглощения и флуоресценции таутомеров ОН К. Спектры поглощения нуклеиновых кислот в ближней УФ области практически совпадают со спектрами ОНК. Сахарофосфатный остов РНК и ДНК даёт незначительный вклад в спектр1 поглощения выше 200 нм. Спектры четырёх дезок-синуклсозидов были изучены как функции pH [94]; они имеют плохо выраженную колебательную структуру из-за низкой симметрии и перекрывания нескольких полос поглощения, отвечающих /га* переходам.
Спектры поглощения нуклеозидов чувствительны к pH среды и наличию заместителей. Так, протонирование Cyt и Gua и депротонирование Ura и Thy приводит к значительному смещению полос поглощения в длинноволновую область. Такая же картина наблюдается и в случае протонирования Ade, хотя это смещение менее значительно. Редкие основания, такие как 4S-уридин, имеют заметное смещение длинноволновой полосы поглощения (Атач=340 нм), что позволяет использовать УФ измерения для определения присутствия минорных компонент нуклеиновых кислот [1 1,94]. Ранние работы по расчёту электронных спектров не учитывали тот факт, что в зависимости от агрегатного состояния могут доминировать определённые таутомер-ные формы ОНК. Именно поэтому наблюдались значительные расхождения экспериментальных и вычисленных значений энергий электронных переходов и сил осцилляторов [95, 96]. Например, при сравнении экспериментальных и вычисленных методом НАМ/3 электронных спектров поглощения Ade-NoH и Gua-NyH авторы работы [97] использовали экспериментальные
34
спектры, измеренные для разных фазовых состояний без уточнения их тау-томерных форм [98-102].
Теоретическое исследование электронных спектров таутомеров Pur-N7H и Pur-N9H проведено в работе [103]. В полном согласии с экспериментом для неполярного растворителя два низших яте* синглетных перехода имеют энергию возбуждения 4.7 и 5.1 эВ; в водном растворе длинноволновая полоса сдвигается в красную область. Удовлетворительная интерпретация электронного спектра выше 5.5 эВ возможна лишь в том случае, если электронный спектр является суперпозицией обоих таутомеров. Две полосы поглощения в неполярном растворителе с энергиями перехода, равными 6.2 и
6.6. эВ отвечают \ßh и 1 Ва состояниям Pur-N9H. Отсутствие в спектре водного раствора полосы поглощения с энергией 6.2 эВ обусловлено тем, что в водном растворе равновесие сдвинуто в сторону Pur-N7H, для которого состояние \Bh характеризуется полосой поглощения слабой интенсивности и энергией 6.4 эВ, являющейся плечом па более сильной по интенсивности полосе поглощения, отвечающей состоянию 1Ва Pur-N9II с энергией 6.6 эВ.
Подавляющее большинство экспериментальных спектров поглощения ОНК не имеют разрешённой колебательной структуры [104].
Одной из важных причин исследования спектров люминесценции производных Риг (кофеина, теофиллина, теобромина) является их применение в фармакологии [105]. Из-за чрезвычайно низкого квантового выхода этих соединений в водном растворе (менее 10'3) большая часть экспериментов по записи спектров испускания проведена при низких температурах Т=11 К.
Интерес к исследованию люминесценции нуклеиновых кислот и их компонентов связан как с изучением механизмов поражения нуклеиновых кислот в живых клетках при УФ облучении, так и с исследованием структурных изменений при электронном возбуждении [106-108].
Для Ade и Gua проявление флуоресценции для таутомеров, прогониро-
35
ванных по положениям N9 и N7, существенно различно. Для Ade вклад N9H таутомеров в спектр флуоресценции настолько мал, что экспериментально проявляется только флуоресценция N7H таутомеров. Этот вывод был сделан на основе следующих экспериментальных фактов: (1) в спектре флуоресценции проявляется чёткая колебательная структура, которой нет в спектре поглощения (правило зеркальной симметрии нарушается); (2) квантовый выход флуоресценции сильно зависит от длины волны возбуждения, возрастая в несколько раз от 260 нм (максимум спектра поглощения) к 280 нм; (3) 7-метиладенин люминесцирует в 200 раз лучше, чем 9-метиладенин [ 107].
Для Gua в спектрах проявляется флуоресценция обоих таутомеров со сравнимыми по величине вкладами. Этот вывод подтверждается исследованиями люминесценции таутомеров ацикловира [106].
Определение геометрических параметров ОНК в электронно-возбуждённых состояниях Определение геометрии молекулы в основном и возбужденных состояниях - эффективный инструмент исследования физикохимических свойств молекулярных соединений. Например, с помощью рассчитанной геометрии можно проводить анализ влияния водородных связей на изменения частот и интенсивностей колебательных полос поглощения в электронных спектрах.
Геометрические модели ОНК в двух низших пп* и пп* синглетных возбуждённых состояниях были определены для Thy, Ura и Cyt [109]. Расчет показал, что геометрия lira и Thy (за исключением метильной группы) в основном состоянии плоская, а в возбуждённых — неплоская. В случае Cyt только аминогруппа в основном состоянии выходит незначительно из плоскости пиримидинового кольца, а в возбуждённом состоянии геометрия Cyt, также как и Thy, Ura, является неплоской.
Теоретическое исследование физических причин1 различного проявления люминесцентных свойств двух таутомеров Ade и 2-аминопурина N9I-I и N7H было проведено путём анализа геометрии основного и первого синглет-
36
ного возбуждённого состояния тремя различными квантово-химическими методами: AMI, CÏS/6-31G, CASSCF/6-31G [110]. Надо отметить, что все три метода даюг очень близкие значения геометрических параметров возбужденного состояния. Было предложено и рассмотрено три возможных механизма дезактивации возбуждённых уровней: псевдоэффект Яна-Теллера, таутомерные превращения в электронно-возбужденных состояниях и образование твист-состояний. Расчёт геометрии возбуждённых состояний показал, что релаксация Ade имеет ля* характер, а для 2-аминопурина люминесценция связана с яя* возбуждением. Проявление таутомерии в возбуждённом состоянии может быть связано с различием квантовых выходов люминесценции. Так, например, показано, что в возбуждённых состояниях время жизни таутомеров Ade-N9H и 2-амино-Риг-КуН меньше времени жизни тау-томеров Ade-N7H и 2-амино-Риг-Ы9Н.
Аналогичная методика анализа изменения геометрии возбуждённых состояний для'объяснения особенностей спектров поглощения и люминес-цинции была применена и-к другим таутомерам ОНК [111-1 19], в частности исследование оксо-аминных таутомеров Gua позволяют сделать заключение: спектр поглощения соответствует таутомеру Gua- NyH, а спектр испускания - Gua- N7H.
Экспериментальные электронно-колебательные спектры ОНК.
Впервые чёткая колебательная структура спектров поглощения и испускания Pur для кристаллического состояния (Г= 4 К) была зафиксирована авторами работы [120]. В спектре поглощения, который идентифицируется как первый синглетный пя* переход с частотой 31402.9 см'1, колебательные полосы соответствуют 59, 130, 247, 332, 379, 440, 468, 510, 535 и 617 см*1 и имеют очень слабую интенсивность.
Спектр поглощения первого яя* электронного перехода Pur-N7H в газовой фазе при t= 160 °С [121] состоит из двух колебательных полос с часто-
37
тами 800 и 1720 см ' , которые, по-видимому, являются сложными и имеют чонкую колебательную структуру. При интерпретации полос надо также учитывать, что в газовой фазе могут существовать обе таутомерные формы Pur (Pur-N9H И Pur-N?H) [47].
Аналогичный по структуре спектр был получен для твёрдого состояния Ade-N^H-HCl при температуре 77 К: в нём наблюдаются две колебательные полосы с частотами 860 и 1500 см'1 [122].
Сравнение интенсивностей длинноволновой (260 нм) полосы в спектрах поглощения Ade, Thy, Ura, Cyt и Gua показывает сильный сдвиг этой полосы в спектре поглощения Gua но сравнению с другими ОНК, который, по мнению авторов [123], обусловлен неплоской геометрией Gua.
Впервые экспериментальный тонкоструктурный хорошо разрешённый электронно-колебательный спектр поглощения (синглетный П7Г* электронный переход) кристаллов сульфата Ade-N9H был измерен при температуре 10 К авторами работы [124]. Были зафиксированы Np и К7-протонированные формы Ade и проведено отнесение колебательной структуры спектра поглощения.
Колебательная структура УФ спектров поглощения пиримидиновых ОНК (Ura, Thy и Cyt) для первых синглетных ля* переходов была исследована в аргоновой матрице при температуре 11 К, а также для аморфных плёнок при температуре И и 77 К [125]. Показано, что в длинноволновой области спектры Cyt и дейтероци гозина состоят из двух полос поглощения: первая полоса имеет Я.макс=267 нм, а вторая - Хмакс=280 им. Thy и Ura в аргоновых матрицах образуют диффузные спектры с максимумами огибающих полос поглощения, равными ?^К1КС=257 нм и Хмакс=255 нм и колебательными прогрессиями, соответствующими 630 и 660 см’1. При этом возникает неоднозначность в интерпретации колебательной структуры сложной полосы спектра поглощения Cyt. Выдвигаются две версии: либо первая ял*-полоса пред-
38
ставляет собой суперпозицию двух отдельных я71*-полос различных тау гомеров Cyt, либо это связано с автоассоциацией Cyt.
Исследование электронно-колебательных спектров флуоресценции в сверхзвуковой охлаждённой струе позволило получить новые данные о тау-томерных превращениях Ura и Thy при их электронном возбуждении [126]. Действительно, как следует из результатов эксперимента, проведённого, например в газовой фазе при t=200 °С [70], Ura в основном состоянии существует только в диоксо- таутомерной форме. Аналогичная ситуация наблюдается и для Thy. Полученные же спектры флуоресценции имеют две полосы поглощения с хорошо разрешённой колебательной структурой. Первая система полос, для которой энергия 0-0 перехода равна 35288 см'1, идентифицируется как первый электронный пп* переход диоксо-формы Ura, а вторая (30917 см1) отвечает пк* переходу одной из гидрокси таутомерных форм Ura. При этом возникает неопределенность, к какой именно из 12 возможных гидрокси- таутомерных форме Ura принадлежит вторая прогрессия. Аналогичный вопрос возникает и при отнесении второй системы полос спектра флуоресценции Thy (первая система имеет 0-0 переход при 33724 см'1, а вторая при 31111 см'1 ) [126].
Возможность исследования механизма таутомерных превращений с помощью методов электронной спектроскопии была рассмотрена в работе [ИЗ] на примере переноса протона Gua-N9H<->Gua-N7H. Таутомерное превращение Gua-N9H+H4-»GuaH4<-> Gua-N7H+H+, включает несколько этапов: 1) поглощение фотона таутомером N9H в основном состоянии и его последующий переход в возбуждённое состояние; 2) протонирование возбуждённого состояния таутомера N9H; 3) депротонирование возбуждённого состояния с образованием таутомера N7H; 4) люминесценция таутомера N7H и его переход из возбуждённого состояния в основное.
39
Таким образом, проведённый анализ показывает, что спектры поглощения и флуоресценции очень чувствительны к определению таутомерных форм ОН К и с их помощью можно изучать механизм таутомерных превращений.
Надо сказать, что несмотря на большое число работ экспериментального и теоретического характера, расчёты колебательной структуры электронных спектров ОНК до сих пор не проведены. Более того, отсутствуют расчёты и сравнительные характеристики изменений геометрических параметров таутомеров ОНК для первых пяти птс* и 7иг* электронных переходов, которые представляют наибольший интерес с точки зрения исследования механизма мутаций в ДНК, вероятность которых, как известно, возрастает в УФ области.
1.2.3. Спектроскопии высокого временного разрешения
Электронное возбуждение молекулы может привести к изменению её важнейших физических и химических свойств, например, константы тауто-мерного равновесия, реакционной способности и т.д. Но, несмотря на интенсивное исследование ОНК в последние полвека, целый ряд фотофизических параметров их электронно-возбуждённых состояний до сих пор не определён. Известно, что время жизни возбуждённого синглетного состояния при комнатной температуре изменяется в пределах 1-5-10 пс [128], а квантовый выход флуоресценции составляет 10'4-10'6 [129]. Последнее обстоятельство серьёзно усложняет измерение фотофизических параметров стандартными методами и является причиной довольно низкой точности экспериментальных результатов [130]. Например, оценка величины времени жизни Ас1е в первом возбуждённом синглетном состоянии имеет разброс значений от 1 до 8 пс [131-132].
При исследовании физико-химических свойств ОНК важно знать ме-
40
ханизм переноса протона при таутомерии. В частности, это знание может помочь объяснить причины мутаций пар ОНК, что является важной задачей биохимии.
Нужно иметь в виду что мономолекулярные реакции структурной изомеризации, к которым относится и таутомерия, могут быть очень быстрыми и проходить за время порядка 10’ы с, поэтому необходимы специальные экспериментальные методы с высоким временным разрешением.
Одним из эффективных методов исследования элементарных процессов химических превращений молекул, развитым в последнее время, является фемтосекундная спектроскопия. Данный спектральный метод основан на использовании сверхкоротких лазерных импульсов для инициирования фотохимических реакций и зондирования продуктов распада вещества во времени с высоким разрешением. Он позволяет косвенно (по спектрам) наблюдать и изучать динамику реакции (в частности, процесса гаутомеризации).
Первый опыт применения метода спектроскопии высокого временного разрешения для определения времени жизни некоторых ОНК в Sr состояниях нельзя назвать вполне удачным; точность определения времени жизни была низкой, поскольку использовались относительно длинные, пикосекундные лазерные импульсы (~3.5 пс) с длиной волны 266 нм [131]. Тем не менее, с помощью пикосекундной спектроскопии были проведены исследования синглетных возбужденных состояний ОНК в полярных растворителях. Типичное время жизни для Si-состояний пуриновых оснований в водных растворах лежит в пределах 6-9 пс; для пиримидиновых оснований - 1-2 пс. Для нуклеозидов и нуклеотидов время жизни уменьшается ДО I I1C. В менее полярных растворителях, таких как, например, этанол или ацетонитрил, время жизни ОНК в Si-состоянии значительно увеличивается и достигает 16 пс.
Эти данные несколько отличаются от аналогичных результатов, полученных в работе [ 128]: для Ura, уридина и Thy время релаксации состояния S| составляет 4±2 пс, для Ade и Cyt - < 4 пс.
41
Si составляет 4±2 ис, для Ade и Cyt — < 4 11c.
Согласно результатам работы [126] время жизни возбуждённых состояний пуриновых оснований больше, чем для пиримидиновых; например, для полиаденина и Ade в водном растворе время жизни в первом синглетном состоянии составляет 6 и 8 пс, соответственно. Однако измерения в поляризованном излучении, результаты которых приведены в работе [131], показали другие величины: 7.0 (Thy), 7.7 (Cyt), 3.9 (Ade) и 7.8 пс (Gua).
Развитие фемтосекундной техники позволило существенно повысить точность измерения и увеличит!» диапазон длин волн возбуждающе!'О излучения (250-г280 нм) [132-142]. Стали возможны более тонкие и сложные измерения, в частности, определение зависимости времени жизни синглетных состояний и квантового выхода флуоресценции от температуры или от pH, причём в большом интервале их изменений.
Например, для Thy в водном растворе при рН^б.8 время жизни S|-состояния (ЯЛ)й;=282нм) равно 1.2+0.2 пс [126]. Более сложный эксперимент, заключавшийся в исследовании спектров поглощения и флуоресценции Thy в водном растворе в зависимости от pH и комнатной температуры был выполнен в работе [143]. Анализ спектров поглощения (pH 4-5-8, Лтг0 =240-5-300им) показал, что в растворе могут присутствовать как диоксо-, так и гидрокси-формы Thy, времена жизни возбуждённых состояний которых равны 0.72 и 3.87 не, соответственно. В растворах с pH <3 могут находиться протонированные гидрокси-формы, для которых время жизни возбуждённых состояний составляет 4.2 не, а в растворах с pH >8 содержится смесь нейтральных таутомеров гидрокси-, диоксо-форм, а также их анионов. Время жизни анионов меньше 0.05 не.
Аналогичное исследование спектров флуоресценции и поглощения были проведены для 5C1-Ura при рН=4 и = 240 ^300им [144]. Согласно
полученным результатам, спектры поглощения и флуоресценции являются
42
суперпозицией спектров 5С1~ига и его гидрокси- таутомера 321. При рН=10 в спектр флуоресценции основной вклад дают анионные формы, а при рН-7 помимо анионных форм, в спектре содержатся нейтральные диоксо- и гидрокси- таутомеры 5С1-ига.
Итак, обзор и анализ литературы по спектрам высокого временного разрешения (пико- и фемтосекундным) показал, что результаты этих экспериментов, которые изначально несут в себе информацию о динамике химического процесса, не в полной мере использованы для выяснения механизма переноса протона в ОИК. Но расчётов, которые могли бы внести ясность, например, в решение вопросов, как зависит перенос атома водорода от pH среды, каков механизм переноса атома водорода и какие таутомерные формы при этом образуются, в настоящее время нет.
Кроме того, исследование динамических спектров флуоресценции О НК позволяет получат!» информацию об их электронно-возбуждённых состояниях, поэтому с помощью фемтосекундных спектров можно решать задачи, связанные с интерпретацией спектров поглощения. Например, рассчитав время жизни синглетных состояний для разных таутомерных форм ОИК и сопоставив эти величины с экспериментом, можно определить, какому из таутомеров принадлежит та или иная колебательная прогрессия.
1.2.4. Основные признаки таутомерии
Как уже упоминалось выше, исторически понятие таутомерии было введено К. Лааром для объяснения двойственного характера вещества (“О возможности нескольких формул строения для одного и того же соединения”, 1885 г.). В 1896 г. Клайзен и его сотрудники получили две формы (а и (3) ацетил дибензоил метана, являющиеся кетонной и енольиой формами ве-
43
щества. Было показано, что в отсутствие реагентов образуется равновесная смесь, но если присутствует реагент, способный взаимодействовать с одной формой, то активная форма всё время образуется из неактивной; таким образом, равновесие смещается, пока в конце концов всё вещество не вступит в реакцию, как если бы оно представляло собой одну активную форму. В случаях, изученных Клайзеном, реакция превращения проходит медленно и благодаря этому её легко можно наблюдать, но если такие превращения происходят быстро, то вещество1 проявляет двойственный химический характер в зависимости от реагента, действию которого он подвергается.
Присутствие реагентов, т.е. химическая; реакция, нужна для того, чтобы помочь выявить ту или иную таутомерную форму, “...поскольку явление, примером которого они служат, выходит за пределы экспериментальных и человеческих возможностей. Величины, которые не могут быть измерены, не менее важны с философской точки зрения, чем измеримые” [145].
Молекулир пость и обратимость атомной перегруппировки. Рассмотрим, когда и при каких условиях молекулярное соединение проявляет таутомерию.
Для активирования какой-либо потенциально таутомерной молекулярной системы необходимо выполнение условия энергетического равновесия между образующимися таутомерными формами.
Это возможно, например, в колебательно-возбуждённых состояниях, когда энергия превышает высоту активационного барьера, или в результате подъбарьерного квантово-механического туннелирования.
Привести потенциально таутомерную структуру в то электронно-колебательное состояние, где этот потенциал реализуется, можно разными экспериментальными способами. Известно, что некоторые таутомерные превращения могут осуществляться только в определённом температурном интервале и не происходят за его пределами. Важно учитывать и влияние специфики условий образования таутомеров. Например, таутомерное равнове-
44
сие для некоторых молекулярных соединений под действием УФ облучения может заметно увеличить скорость таутомерного образования.
На осуществление равновесных процессов таутомерии существенное влияние оказывают катализаторы: «...это справедливо даже в классическом случае таутомерии ацсгоуксусного эфира. При этом возникают также вопросы о целесообразности отнесения подобных процессов к таутомерным и о необходимости разграничения специфически катализируемых обратимых взаимопревращений мономолекуляриых систем от некатализируемых тауто-мерных процессов» [22].
Сог ласно квантово-химическим расчётам, перегруппировка структурно нежёстких молекул, связанная с внутримолекулярными реакциями разрыва и образования химических связей, совершается, главным образом, но туннельному механизму.
Примером может служить вырожденная таутомерия енола малонового диальдегида (К|=К2=Н) [9]. Сопоставление результатов неэмпирического расчёта с экспериментальными данными, полученными с помощью методов микроволновой спектроскопии, свидетельствуют о том, высокая скорость протонных миграций (6.3- 10й Гц) обусловлена эффектами туннелирования. Подъбарьерные переходы между двумя минимумами симметричного потенциала подтверждаются наличием туннельного расщепления колебательных уровней, которое для малонового альдегида составляет 23 см’1. Невырожденные системы (11|^Я2) характеризуются локализацией собственных функций вблизи минимума потенциальной поверхности, и только при приближении к вершине барьера повышается вероятность обнаружения протона в обоих минимумах потенциала.
Поскольку для всех оснований нуклеиновых кислот двухъямный потенциал имеет несимметричный профиль, то внутримолекулярный перенос водорода (прогона) вероятнее всего протекает через колебательновозбуждён ные состояНИЯ.