РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальні тварини.
У дослідженнях, присвячених механізмам хронічних форм підвищення судомної активності, у тому числі при синдромі толерантності до дії нейротропних агентів, найбільш часто застосовуваним oб'єктoм дослідження є мозок щура [52, 76, 105, 307]. Основні закономірності виникнення й розвитку синдрому толерантності, а також синдрому відміни фармакологічних агентів, механізмів їхнього гальмування, установлені на даному експериментальному об'єкті, були підтверджені при створенні подібних моделей на інших видах тварин [53]. Виходячи зі сказаного, а також ґрунтуючись на цілях і задачах дослідження, у даній роботі в якості експериментальних тварин були обрані статевозрілі щури обох статей лінії Вістар.Робота з експериментальними тваринами проводилася у відповідності до вимог, викладених в "Міжнародних рекомендаціях із проведення медико-біологічних досліджень з експериментальними тваринами", запропонованих Радою міжнародних медичних організацій в 1985 р., розробленому на їхній основі додатку до Наказу Міністерства охорони здоров'я СРСР N 755 від 12.08.1977 р. "Про заходи для подальшого вдосконалювання форм роботи з використанням експериментальних тварин", а також у відповідності з зауваженнями, викладеними в "Листі комісії по проблемі етики відносини до тварин" [Успехи физиологических наук. - 1993- Т.24, N4.- С.108].
Дослідження проводилися в умовах гострого й хронічного експерименту на 296 білих щурах лінії Вістар вагою від 180 до 320 г. Тварин утримували в індивідуальних боксах c природною зміною світла й темряви, з вільним доступом до води і їжі. З метою приручення, щурів перед початком експерименту тримали в руках по 2-3 хвилини протягом 5 днів, що полегшувало наступні експериментальні дослідження з тваринами [5].
2.2. Моделі епілептичної активності
2.2.1. Ф а р м а к о л о г і ч н и й к і н д л і н г. Для відтворення фармакологічного кіндлінгу тваринам здійснювали 20-24 щодобових однократних внутрішньоочеревинних введень підпорогових доз коразолу (25,0-30,0 мг/кг) [38, 40, 73, 75]. Коразол чинить ефекти, блокуючи хлорний канал рецепторів ГАМК і порушуючи тим самим ГАМК- ергічний гальмівний контроль [205]. Установлено, що коразол може також викликати активацію мембранних фосфоліпідів, протеаз і нуклеаз [108]. У свою чергу, фосфоліпоінозітиди відіграють важливу роль у міжклітинній сигналізації, формуванні вторинних мессенджерів, активуванні генів, що забезпечують швидкі адаптивні зміни, і в остаточному підсумку - у формуванні довгострокових пластичних відповідей на діючий стимул. Одним з наслідків порушень функціонального стану фосфоліпідів мембран, що викликано впливом коразолу є вивільнення вищих жирних кислот, діацилгліцеридів, эйкозаноїдів, перекисних сполук ліпідів і радикалів кисню. Тому, при введенні епілептогенів має місце посилена пероксидація ліпідів і протеїнів, зниження рівня глутатіону, а також активності ензимів, що забезпечують антиоксидантний захист [78, 95, 122, 156].
Важливою особливістю коразол- індукованого судомного синдрому є його відповідність абсансним проявам епілепсії [76, 102, 145, 88, 204]. Тому дана модель й, зокрема, рання фаза кіндлінг- синдрому була застосована в дослідженні як модель абсансної епілепсії на якій досліджували ефекти ЕП кори мозочка.
Епілептоген вводили в обсязі 0,10-0,20 мл в однакових умовах (в один і той же час доби, у лабораторії c однаковою освітленістю, вологістю, температурою й шумовим фоном). Після ін'єкції конвульсанта щурів поміщали в індивідуальні прозорі пластмасові камери (10 см х 25 см х 30 см) і спостерігали на протязі 60 хв. Тваринам контрольних груп в аналогічних умовах вводили однакову кількість 0,9% фізіологічного розчину NаСl (рН=7.4).
На ранній стадії кіндлінгу, індукованого коразолом, абсансні прояви судорог веріфікували по характерним малим судомним реакціям тварин - завмирання, тремору вібрис і голови, посмикуванням окремих груп м'язів морди й шиї, короткочасним частішанням дихальних рухів, а також ністагму [102, 116]. Крім того, як показники судомної активності досліджували характерну СХ- вибухову активність, що реєстрували в корі головного мозку. Досліджували середню тривалість і частоту розвитку подібних СХ- комплексів [102, 116].
Інтенсивність судомних реакцій на пізній стадії коразолового кіндлінгу визначали візуально й оцінювали в такий спосіб: 0 балів - відсутність судомної реакції; 1 бал - міоклонічні здригування голови або тіла; 2 бали - клонічні судоми м'язів тулуба й кінцівок; 3 бали - підйом на задні кінцівки ("поза кенгуру"), повторні клонуси м'язів передніх кінцівок; 4 бали - генералізовані клоніко-тонічні судоми з падінням тварин на бік, вегетативними розладами й післяприступною депресією; 5 балів - смертельні судоми або повторні генералізовані клоніко-тонічні пароксизми [38, 40, 73, 74].
2.2.2. О с е р е д к о в а е п і л е п т и ч н а а к т и в н і с т ь. Створення осередків епілептогенезу шляхом впливу епілептогенів, що мають різні механізми нейрохімічного впливу, дає можливість оцінити стан ряду нейромедіаторних систем при різних функціональних станах мозку [18, 76]. Зокрема, дана методика дозволила провести динамічну оцінку активності ГАМК-ергічної системи, а також ендогенної системи збуджуючих амінокислот при хронічному епілептичному синдромі [15, 76]. Тому представлялося доцільним застосувати дану методику в толерантних до дії діазепаму тварин.
Поодинокі епілептичні осередки були створені y щурів в умовах штучної вентиляції легень і м'язової релаксації за допомогою розчину d-тyбокyрарину (0,2 мг, в/очер). Підготовчі операції (трахеотомія, трепанація черепа) здійснювали під кетаміновим (2,0 мг/кг) наркозом. М'які тканини країв операційних ран інфільтрували 0,5% розчином новокаїну. Місцеве знеболювання повторювали кожні 1,5-2,0 години. Штучне дихання провадили за допомогою апарата фірми G.F.Palmer Ltd (Англія).
Після розсічення твердої мозкової обо