РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал і методи дослідження
Об'єктом дослідження служили 1109 культур моноцитів і 1145 культур нейтрофілів периферійної крові здорових донорів, а також 1090 культур ентероцитів тонкої кишки курей.
Культури моноцитів і нейтрофілів були виділені з периферійної крові 35 дорослих практично здорових чоловіків і 45 жінок віком від 40 до 50 років, які постійно мешкали в м. Луганську і Луганській області (разових донорів обласної станції переливання крові). Ретельне опитування і детальний огляд дозволили виключати в обстежених наявність хронічної патології, а також захворювань, перенесених ними в останні шість місяців. У всіх обстежених натще брали кров на загальний аналіз, після чого забирали кров з вени ліктьового згину для виділення моноцитів і нейтрофілів. Популяції моноцитів і нейтрофілів периферійної крові одержували за допомогою центрифугування на подвійному градієнті щільності 1,077 і 1,093 фіколу-верографіну.
Суспензію ентероцитів одержували з кишечників здорових курей, забитих перед дослідом. Відрізок тонкого кишечника розкривали подовжнім розтином, старанно відмивали в розчині Хенкса з антибіотиками від крові, жирових компонентів, клітинного детриту та інших домішок до повної прозорості розчину. Відокремлений прошарок слизової оболонки кишечника заливали розчином трипсину і диспергували піпетуванням. Надосадову рідину, яка містила трипсинізовані клітини, зливали і поміщали в холодильник при температурі +4?С. Трипсинізацію повторювали декілька разів. Завись клітин тричі відмивали в середовищі 199 центрифугуванням при 1000 оборотів за хвилину протягом 5-10 хвилин. Визначали кількість клітин у середовищі за допомогою камери Горяєва. Клітинну суспензію розводили живильним середовищем до концентрації 6*105 клітин в 1 мл і використовували в дослідах. Частину клітин поміщали у флакони з середовищем 199 і культивували при +35-37?С протягом 48-96 годин, після чого клітини використовували в дослідженнях. Відмивання моношару ентероцитів від стінок флаконів проводили 0,02 % розчином Версена протягом 3-5 хвилин в термостаті.
ЛПС одержували з культур мікроорганізмів роду Salmonella (S. gallinarum-pullorum, S. typhimurium, S. enteritidis). Ідентифікацію сальмонел проводили з використанням діагностичних наборів "Ентеротест 24" виробництва фірми Мікро-ЛА-Тест, АТ "Лахема", Чехія. Препарати ЛПС одержували водно-феноловою екстракцією при 65?С [30, 70, 115, 116, 121]. Очищення виконували обробкою 50 нг/мл РНКазою (фірми Sigma) і 16 нг/мл ДНКазою (фірми Sigma) з наступним діалізом через 50 М трис-буфер і центрифугуванням при 20 000 g протягом 30 хвилин. Осадок сушили ліофільно. Для відновлення активності ЛПС та їх структурних компонентів застосовували редокс-обробку. Розчини ЛПС обробляли 2-меркаптоетанолом з кінцевою концентрацією 0,1 М протягом 18 годин при 4?С. Розчин зберігали при -20?С. Перед використанням розчин обробляли ультразвуком у водяній лазні протягом 5 хвилин.
З метою визначення концентрацій сальмонельозного ЛПС, призначених для стимуляції моноцитів, нейтрофілів і ентероцитів, нами було проведено встановлення ЛД50 ЛПС. Для цього було протестовано 7 різних концентрацій сальмонельозного ЛПС: 0,25-0,5-1,0-1,5-2,0-2,5-3,0 мкг/кг маси тіла. Зазначені дози ЛПС вводили одноразово підшкірною ін'єкцією здоровим куркам масою 2-3 кг, за якими спостерігали протягом 4 днів. Кожну концентрацію ЛПС тестували на групі птиць, що складалась з 6 курей. В результаті проведеного дослідження встановлено, що ЛД50 (загибель 50 % тварин протягом 4 днів) для сальмонельозного ЛПС складала 2 мкг/кг. Виходячи з цього, для стимуляції in vitro моноцитів, нейтрофілів і ентероцитів прийняті такі концентрації сальмонельозного ЛПС: 0,001-0,01-0,1-0,5-1,0-2,0 мкг/л (0,01-0,1-1,0-5,0-10,0-20,0 нг/мл), що, відповідно, складало 1/2000-1/200-1/20-1/4-1/2-1,0 ЛД50. При однократній ін'єкції ендотоксину в дозі 2 мкг/кг у птахів розвивались діарея, адінамія, підвищення частоти серцевих скорочень, задишка, лихоманка. Втрата маси тіла до кінця доби сягала 8-10 % від початкової. До кінця четвертої доби 50 % курей загинуло.
З метою визначення ЛД50 сальмонельозного ентеротоксину використовували супернатант добової бульйонної культури S. gallinarum-pullorum. Супернатант одержували в результаті центрифугування бульйонної культури сальмонел при 3000 оборотів в хвилину протягом 1 години. Через неможливість визначення абсолютного вмісту ентеротоксину в супернатанті, для встановлення ЛД50 сальмонельозного ентеротоксину використовували об'ємний метод. Для цього супернатант в об'ємах 0,5-1,0-1,5-2,0 мл перорально вводили чотирьом групам здорових курей масою 2-3 кг, спостереження за якими здійснювали протягом 3 днів. Кількість піддослідних курей в кожній групі складала 6. Встановлено, що ЛД50 ентеротоксину сальмонел відповідала 1,5 мл супернатанту. Загибель 50 % піддослідних курей до кінця третьої доби наступала при розвитку діареї. Виходячи з об'єму супернатанту, що містить ЛД50 сальмонельозного ентеротоксину, розчинення ентеротоксину, використані для стимуляції моноцитів, нейтрофілів і ентероцитів, склали відносно вихідного об'єму 1/100-1/10-1/2-1,0 ЛД50 сальмонельозного ентеротоксину. Супернатант сальмонельозного ентеротоксину зберігали в стерильних умовах при температурі -18?С. Робочі розчинення ентеротоксину для проведення дослідів готували ex tempore.
З метою вивчення ефективності інактивації сальмонельозних ЛПС і ентеротоксину нами були використані наступні речовини:
(1) Оцтова кислота в концентрації 1,0 %.
(2) Перекис водню (гідроперекис) в концентрації 3,0 %.
(3) Суміш розчинів 1,0 % оцтової кислоти і 3 % гідроперекису.
Бактеріцидну дію кожної концентрації оцтової кислоти, гідроперекису та їх суміші визначали на живих культурах S. gallinarum-pullorum. Для цього використовували бактеріальну суспензію з концентрацією 6 lg бактерій в 1 мл, яку визначали з допомогою оптичного приладу для встановлення кала