РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження фармакокінетики аміксину було проведено з використанням -
радіоактивного аналога препарату [3Н]-аміксину, синтезованого в
Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України і СП "ІнтерХім".
Методи синтезу, докази хімічної будови були викладені в роботах [40, 41, 42].
У ході науково-дослідної роботи також використовувалися: TRITON Х-100,
2,5-дифенилоксазол (ПОПОП), 1,4- біс-2-(5-феніл) оксазолилбензол (ППО) і рідкі
сцинтиляційні суміші фірми «Сanberra- Paсkard». Інші реактиви виробництва фірми
“Acros” марки ч.д.а. та о.с.ч.
Досліди були проведені на нелінійних мишах-самцях масою 20-25 г.
Експериментальні тварини витримувалися на повноцінній лабораторній дієті при
природному світловому циклі. Піддослідних тварин розділили на три групи: 1)
одноразово вводили [3Н]-аміксин; 2) багаторазово (впродовж 5 діб) вводили
[3Н]-аміксин; 3) вводили нерадіоактивний препарат – впродовж 4 діб, потім на 5
добу одноразово [3Н]-аміксин. Досліджувані водорозчинні сполуки ([3Н]-аміксин
та його нерадіоактивний аналог) вводили перорально в ізотоничному розчині NaCl
у дозі 50мг/кг.
Вибір дози препарату грунтувався на підставі попередних досліджень його
фармакодинамикі [114] і є оптимальною для кількісного визначення загального
радіоактивного матеріалу.
2.1. Методи дослідження фармакокінетики [3Н]-аміксину
2.1.1. Оптимізація методів екстракції загального радіоактивного матеріалу з
біологічного матеріалу в модельних експериментах.
Для створення оптимальних умов екстракції лікарських речовин з біологічного
матеріалу найчастіше використовуваються модельні досліди з наступним
розрахунком метрологічних характеристик [132, 133].
Для визначення параметрів процесу кінетики екстракції загального радіоактивного
матеріалу в модельних експериментах - дослідах in vitro, контрольних тварин під
нембуталовим наркозом присипляли та відбирали зразки органів та тканин
(печінки, нирок, легенів, селезінки, серцевого м’язу та головного мозку),
вилучали наважки органів і готували гомогенати у фізіологічному розчині у
співвідношенні 1:5. До 1 см3 гомогенатів органів мишей додавали [3Н]-аміксин у
зростаючих дозах. Потім здійснювали рН-залежну п'ятиразову хлороформну
екстракцію (5 см3 хлороформу). Після поділу фаз (водна фаза - органічна фаза)
пастерівською піпеткою відбирали хлороформ після кожної екстракції.
Вся відібрана кількість хлороформу випарювалася, заливалася толуольним
сцинтилятором та визначалася загальна радіоактивність кожної екстракції на
рідинному сцинтиляційному лічильнику TRI-CARB 2700 TR (Canberra-Packard, USA).
2.1.2. Оптимізація методів екстракції загального радіоактивного матеріалу з
біологічного матеріалу in vivo.
Для оптимізації процесів екстракції загального радіоактивного матеріалу та
окремих метаболітів препарату з біологічних рідин у дослідах in vivo
проводилася рН-залежна рідин-рідинна екстракція хлороформом. Експериментальним
тваринам протягом чотирьох діб вводили нерадіоактивний препарат, а на п’яту
добу [3Н]-аміксин. Всі сполуки вводили перорально, одноразово на добу, в дозі
50 мг/кг.
Для дослідження біотрансформації препарату в організмі мишей, через добу після
введення радіоактивного препарату експериментальних тварин під нембуталовим
наркозом присипляли та відбирали зразки печінки, зважували наважки органів і
готували гомогенати у фізіологічному розчині у співвідношенні 1:5. Потім
проводили 5-ти кратно екстракцію 5 см3 хлороформа.
Для одержання продуктів екскреції експериментальні тварини знаходилися в
метаболічних клітках “Simax”, з вільним доступом до води та їжі. Відбір сечі та
калу проводили один раз на добу, впродовж необхідних діб (двох) після введення
радіоактивного препарату. Відбирали 1 см3 сечі і препарат екстрагувався 5-ти
кратно послідовно 15 см3 хлороформу. Наважка калу становила 10 мг, розчиняли в
1 см3 води і проводили екстракцію тим же об`ємом хлороформу.
Після поділу фаз (водна фаза - органічна фаза) пастерівською піпеткою відбирали
хлороформ після кожної екстракції. Вся відібрана кількість хлороформу
випарювалася, заливалася толуольним сцинтилятором та визначалася загальна
радіоактивність кожної екстракції на рідинному сцинтиляційному лічильнику
TRI-CARB 2700 TR (Canberra-Packard, USA).
2.1.3. Хроматографічний метод розділення аміксину і його вільних метаболітів.
Наведені методи дозволяють визначити загальний вміст радіоактивного матеріалу,
суми екстрагуємих хлороформом (вільних) і водорозчинних метаболітів аміксину.
Дослідження фармакокінетики лікарського засобу неможливо без кількісного
визначення вихідної сполуки та продуктів його біотрансформації. Найбільш
зручним та розповсюдженим є метод хроматографування і подальше встановлення
структури індивідуальних сполук фізико-хімічними методами. Розділення
[3Н]-аміксину і його метаболітів проводили методом зонної радіохроматографії. У
цьому випадку використвували хроматографію в тонкому шарі на платівках Сілуфол
УФ-254. Спочатку проводили 95% вилучення загального радіоактивного матеріалу з
біологічних рідин, всі хлороформні екстракти об’єднували та випаровували для
наступного радіохроматографічного аналізу вихідної сполуки і метаболітів
аміксину [134]. Всі відібрані екстракти розчиняли у 10 мл хлороформу та
наносили у вигляді лінії 2,5 - 3 см на 3 см вище нижнього краю пластинки,
загальна довжина якої становила 15 см. Для відокремлення коекстрактивних
речовин хроматографію проводили в чотирьоххлористому вуглеводні в напрямку до
нижнього краю платівки. У цьому випадку аміксин і його похідні залишалися на
стартовій лінії, а коекстрактивні
- Киев+380960830922