РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
З метою дослідження впливу підвищеного рівня жиру і лінолевої кислоти та вітаміну Е в раціоні гусок на загальний вміст ліпідів, їх жирнокислотний склад і співвідношення окремих класів, вміст вітаміну Е і продуктів перекисного окиснення ліпідів у жовтку яєць та тканинах ембріонів і гусенят проведено два наукових і один виробничий дослід.
Метою першого досліду було дослідження впливу підвищеного рівня жиру і лінолевої кислоти та вітаміну Е в раціоні гусок на вміст ліпідів і їх жирнокислотний склад та вміст вітаміну Е і продуктів перекисного окиснення ліпідів у жовтку яєць, печінці, скелетних м'язах і жовтковому мішку ембріонів і гусенят.
Дослід проведено на трьох групах гусок 2-річного віку, по 4 голови в кожній, в умовах віварію в Інституті біології тварин УААН. Гуски 1-ї групи, яким згодовували стандартний комбікорм (НРК-18), який забезпечував їх потребу в усіх елементах живлення згідно норми, правили за контроль. Вміст сирого жиру в комбікормі становив 3,7%, вміст лінолевої кислоти - 7 мг/кг, вміст вітаміну Е - 10 мг/кг. Гускам 2-ї групи протягом двох місяців - за місяць до початку яйцекладки і місяць протягом яйцекладки - згодовували той же комбікорм, до якого додавали 3% соняшникової олії. Вміст сирого жиру в раціоні гусок 2-ї групи становив 6,7%, вміст лінолевої кислоти - 22 мг/кг, вміст вітаміну Е - 10 мг/кг. Гускам 3-ї групи протягом 2-ї місяців згодовували той же комбікорм, до якого додавали 10 мг/кг токоферил ацетату. Загальний вміст вітаміну Е в раціоні гусок становив 20 мг/кг комбікорму.
Частину одержаних від гусок кожної групи яєць використовували в дослідженнях, а частину підкладали під гусок. У дослідженнях використовували 25-денні ембріони та 1- і 3-денні гусенята, виведені з яєць, одержаних від гусок кожної групи. Для біохімічних досліджень використовували одержані від ембріонів і гусенят зразки печінки, стегнових м'язів і залишкового жовтка, які відразу після взяття заморожували у рідкому азоті і зберігали у такому стані до початку досліджень. У жовтку яєць і тканинах ембріонів і гусенят визначали загальний вміст ліпідів, їх жирнокислотний склад і відносний вміст окремих класів ліпідів, вміст вітаміну Е і продуктів перекисного окиснення ліпідів - дієнових кон'югатів, гідроперекисів ліпідів і малонового діальдегіду, за методами, описаними нижче.
Метою другого досліду було дослідження впливу підвищеного рівня жиру і лінолевої кислоти, а також різного рівня вітаміну Е в раціоні гусок на вміст ліпідів і їх жирнокислотний склад та вміст вітаміну Е і продуктів перекисного окиснення ліпідів у жовтку яєць, печінці і жовтковому мішку гусенят у 1- і 5-денному віці. Гуски 1-ї групи, яким згодовували стандартний комбікорм (НPK-18), який забезпечував їх потребу в основних елементах живлення згідно норми, правили за контроль. Вміст сирого жиру в комбікормі становив 3,7%, вміст лінолевої кислоти - 7 мг/кг, вміст вітаміну Е - 10 мг/кг. Гускам 2-ї групи протягом двох місяців - за місяць до початку яйцекладки і місяць протягом яйцекладки - згодовували той же комбікорм, до якого додавали 3% соняшникової олії. Вміст сирого жиру в раціоні гусок 2-ї групи становив 6,7%, вміст лінолевої кислоти - 22 мг/кг, вміст вітаміну Е - 10 мг/кг. Гускам 3-ї і 4-ї груп згодовували той же комбікорм, до якого додавали відповідно 10 і 30 мг токоферил ацетату. Загальний вміст вітаміну Е в раціоні гусок 3-ї і 4-ї груп становив відповідно 20 і 40 мг/кг комбікорму.
У яйцях, одержаних від гусок кожної групи, визначали вміст вітаміну Е. У печінці і залишковому жовтку гусенят 1- і 5-денного віку, виведених з яєць, які знесли гуски 3-ї і 4-ї груп, визначали загальний вміст ліпідів, їх жирнокислотний склад і відносний вміст окремих класів ліпідів, вміст вітаміну Е і продуктів перекисного окиснення ліпідів - дієнових кон'югатів, гідроперекисів ліпідів і малонового діальдегіду.
Одержані цифрові дані опрацьовували статистично: визначали середню арифметичну величину (М), середню квадратичну помилку (m) і вірогідність різниць (Р) між порівнюваними показниками за допомогою комп'ютерної програми "Microsoft Excel".
2.2. Методи біохімічних досліджень
Визначення загального вмісту ліпідів і співвідношення окремих їх класів.
Ліпіди екстрагували сумішшю хлороформу і метанолу у відношенні 2:1 за методом Фолча і визначали їх кількість ваговим методом [23]. Окремі класи ліпідів виділяли методом тонкошарової хроматографії на силікагелі у системі гексан-діетиловий ефір-льодова оцтова кислота у відношенні 70:30:1 [23]. Їх кількість визначали біхроматним методом за допомогою використання стандартних наборів фірми "Lachema" (Чехія).
Визначення жирнокислотного складу загальних ліпідів.
Жирнокислотний склад загальних ліпідів визначали методом газорідинної хроматографії [37]. Метилові ефіри жирних кислот одержували шляхом прямої переестерифікації і розділяли їх на хроматографі чехословацького виробництва "Chrom-4" з полум'яно-іонізуючим детектором (довжина колонки 2,4 м, ширина - 4 мм, наповнювач поліетиленглікольсукцинат на хромосорбі 60-80 меш, температура випарювача 220?С, температура колонки 183?С, використання Н2 - 30 мл/хв., N2 - 15 мл/хв., повітря - 400 мл/хв.). Жирні кислоти ідентифікували, визначаючи час їх виходу після введення і порівнювали з стандартом, в якості якого використовували метилові ефіри відомих жирних кислот.
Визначення концентрації дієнових кон'югатів.
Кількість дієнових кон'югатів визначали за методом, в основі якого лежить властивість спряжених подвійних зв'язків поглинати випромінювання при довжині хвилі 233 нм [46]. Концентрацію дієнових кон'югатів виражали в нмоль/мл.
Визначення концентрації гідроперекисів ліпідів.
Кількість гідроперекисів ліпідів визначали за їх реакцією з тіоцианатом амонію після попередньої екстракції ліпідів етанолом (відношення спирту до плазми крові - 15:1) [36]. Інтенсивність забарвлення визначали колориметично при довжині хвилі 480 нм. Кількість гідроперекисів ліпідів виражали в од