РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы исследований
Основной объем исследований выполнен на крысах-самцах линии Вистар в возрасте 3-4 мес. Исследования возрастных изменений биоэлектрических свойств кости выполнены на 49 крысах-самцах в возрасте от 1 до 24 мес. Всего было проведено 8 серий исследований на 233 крысах (табл. 2.1).
Таблица 2.1
Серии экспериментов и количество животных в отдельных сериях
исследований
Серия
экспериментовУсловия экспериментаКоличество животных1Исследование потенциала нагрузки бедренной кости крыс322Исследование ПЭС кости при стереотипной функциональной нагрузке243Исследование возрастных изменений ПЭС кости при стереотипной функциональной нагрузке494Исследование ПЭС кости при 28-суточной жесткой гипокинезии в атмосферном воздухе245Исследование ПЭС кости при 45-суточной жесткой гипокинезии в атмосферном воздухе126Исследование ПЭС денатурированной кости 367Исследование кислородного метаболизма бедренной кости крыс в условиях нормо - и гипокинезии248Исследование ПЭС кости при гипокинезии в условиях прерывистой нормобарической гипоксии32
Крыс содержали в условиях вивария Института физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины на стандартном пищевом рационе с доступом к воде и корму ad libitum [37]. Выведение животных из эксперимента проводили путем декапитации после обездвиживания в условиях эфирного наркоза. Исследования проводили в первой половине дня. Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с требованиями биоэтики и международных принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [97].
2.2. Методы и устройства для дозированного ограничения
подвижности крысы
Дозированную гипокинезию создавали путем ограничения подвижности (ОП) животных в герметичном контейнере, состоящем из блока ячеек (рис.2.1). Жесткому режиму ОП соответствовало отношение площади проекции тела животного к площади ограничительной ячейки 1:1 [13].
А
БРис.2.1. Устройство для создания экспериментальной гипокинезии ограниченного пространства у группы крыс: А - контейнер с ограничительными ячейками и крышкой: 1. Корпус контейнера. 2. Крышка контейнера. 3. Индивидуальная ячейка для создания гипокинезии. 4. Ограничивающая крышка ячейки. 5. Кормушка. 6. Автопоилка. 7. Поддон для удаления экскрементов.8. Газораспределительный коллектор. 9. Трубки подачи газовой смеси. Б - устройство в поперечном сечении.
Конструкция контейнера обеспечивала возможность периодической замены атмосферного воздуха в ограничительных ячейках на нормобарическую гипоксическую газовую смесь (НГГС) с парциальным давлением кислорода 91±8 мм рт. ст., что эквивалентно 12об% кислорода.
2.3. Методы создания искусственной газовой среды с пониженным парциальным давлением кислорода
Для получения нормобарических газовых смесей с дозировано сниженным парциальным давлением кислорода и обеспечения автоматического режима их прерывистой подачи в ограничительные ячейки была использована установка, схема которой приведена на рис.2.2.
Рис.2.2. Установка для получения и автоматической подачи гипоксических газовых смесей и атмосферного воздуха в контейнер для моделирования гипокинезии: 1.Ротаметр; 2. Газоразделительный элемент; 3. Компрессор для подачи воздуха на газоразделительный элемент; 4. Компрессор для подачи атмосферного воздуха; 5. Программируемое реле времени подачи атмосферного воздуха; 6. Программируемое реле времени подачи гипоксической газовой смеси; 7. Клапан переключения потоков воздуха и гипоксической газовой смеси; 8. Канал выхода потока атмосферного воздуха или гипоксической газовой смеси на коллектор.
Гипоксическую газовую смесь получали с помощью мембранного газоразделительного элемента, соединенного с безмасляным компрессором атмосферного воздуха и способного развивать давление от 1,5 до 2,5 атмосфер. Периодичность и продолжительность подачи газовой смеси и атмосферного воздуха в контейнер для крыс устанавливали с помощью реле времени, которое в автоматическом режиме обеспечивало включение и отключение компрессора.
Исходя из существующих данных литературы относительно эффективности различных режимов воздействия НГГС [15], в наших исследованиях был использован режим прерывистого гипоксического воздействия: 20 минут - НГГС, 20 минут - атмосферный воздух. Подопытные крысы находились в условия умеренного или жесткого ограничения подвижности на протяжении 28 или 45 суток и ежедневно дышали по 8 часов в сутки (с 24.00 до 8.00) в прерывистом режиме НГГС. Крысы контрольных групп находились на всем протяжении эксперимента в обычных условиях вивария.
2.4. Методы исследования потенциала нагрузки
Исследование потенциалов нагрузки проводили на свежевыделенных бедренных костях крыс. Для регистрации ПН использовали установку, схема которой приведена на рис.2.3. Установка состоит электронного блока на основе трехкаскадного усилителя электрических сигналов, таймера, устройства для фиксации и увлажнения кости, хлорсеребряных электродов и регистратора. Максимальное разрешение прибора составляло 10 мкВ, базовая погрешность - 0,05%.
В исследованиях использовали Ag-AgCl электроды c солевым мостиком из 0,9% NaCl в 2% агаре [89]. Электроды располагали в центре диафиза бедренной кости. При этом электрод, расположенный на вогнутой стороне кости, подключали к инвертирующему входу, а электрод противоположной стороны - к неинвертирующему входу усилителя. Для поддержания кости во лажном состоянии использовали систему капельного увлажнения 0,9% раствором хлорида натрия, рН=7,2. Исследования проводили при температуре 20-22°С.
Механическую нагрузку на кость осуществляли в аксиальном направлении. Величину нагрузки рассчитывали исходя из условий физиологического распределения весовой на