СОДЕРЖАНИЕ
2
стр.
ВВЕДЕНИЕ................................................... 5
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР......................................... 7
1.1. Staphylococcus aureus и формы его существования в объектах
ветеринарно-санитарного контроля и окружающей среды ....... 7
1.1.1. Факторы вызывающие образование L-форм.................... 16
1.2. Способы контроля различных форм бактерий................. 18
1.2.1. Микробиологические методы................................ 18
1.2.2. Гибридизация нуклеиновых кислот.......................... 19
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................. 31
2.1. Цель и задачи исследования................................ 31
2.2. Объекты и методы исследования............................. 31
2.2.1. Методы исследования популяций бактериальных клеток 32
2.2.1.1. Метод определения чувствительности бактерий к действию
антибиотиков............................................ 32
2.2.1.2. Метод исследования популяции бактериальных клеток с
использованием мембранных фильтров........................ 32
2.2.1.3. Метод выращивания бактерий в полужидком агаре на
мембранных фильтрах....................................... 32
2.2.1.4. Метод определения степени реверсии бактериальных клеток
после воздействия антибиотиков............................ 33
о
2.2.1.5. Метод изучения температурного фактора на бактериальные
клетки.................................................... 34
2.2.2. Приготовление препаратов для сканирующей электронной
микроскопии............................................... 34
2.2.3. Контаминация мясопродуктов и водных объектов
микроорганизмами.......................................... 34
3
2.2.4. Микробиологические методы определения Staphylococcus
aureus в пищевых продуктах................................. 35
2.2.5. Контроль Staphylococcus aureus на основе методов ДНК-
гибридизации............................................... 36
2.2.5.1. Выделение и очистка ДНК из бактерий........................ 36
2.2.5.2. Выделение и очистка ДНК с использованием
гуанидинтиоизоционата...................................... 37
2.2.5.3. Включение трития в бактериальные ДНК методом
ник-трансляции............................................. 38
2.2.5.4. Включение биотина в бактериальные ДНК методом
ник-трансляции............................................. 40
2.2.5.5. Включение метки в ДНК методом «рассеяной» затравки 40
2.2.5.6. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной
цепной реакции............................................. 42
2.2.5.7. ДНК-гибридизация на мембранных нитроцеллюлозных
фильтрах с реперными ДНК мечеными тритием.................. 43
2.2.5.8. Точечная ДНК-гибридизация на мембранных фильтрах с
биотииилированной ДНК...................................... 44
2.2.6. Статистическая обработка результатов....................... 45
2.3. Результаты исследования.................................... 46
2.3.1. Изучение популяции Staphylococcus aureus после воздействия неблагоприятных факторов (антибиотики, температура) с использованием микробиологических и
электронномикроскопических методов......................... 46
2.3.2. Разработка метода дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий в объектах ветеринарносанитарного контроля с использованием ДНК-гибридизации
на мембранных фильтрах..................................... 56
11
неблагоприятных факторов химической и физической природы, так и под влиянием Ь-трансформирующих агентов, специфически действующих на клеточную стенку.
К несбалансированным формам относятся сферопласты, образующиеся под действием факторов, блокирующих синтез клеточной стенки в условиях жидкой среды и осмотической защиты. Они характеризуются частичным разрушением клеточной стенки. Обычно сферопласты образуются у грамотрицательных бактерий и значительно реже у грамположительных (65).
Механизм образования сферопластов у грамотрицательных и грамположительных бактерий различен, что отражает различия в структуре их клеточной стенки. В клеточной стенке грамотрицительных бактерий происходит нарушение структуры гтептидогликана, что приводит к отхождению наружной мембраны от цитоплазматической и расширению переплазматического пространства. На конце или посередине клетки возникает вздутие, в которое переходит все содержимое клетки.
У грамположительных бактерий при образовании сферопластов, клеточная стенка разрывается в каком-либо одном месте, основная часть стенки лизируется.
Сферопласты и Ь-формы сферопластного типа не утрачивают чувствительность к фагу, так как фаговые рецепторы в стенки сохраняются. При образовании сферопластов резко снижаются патогенные свойства культуры (9, 15, 19, 23, 56, 82, 106, 149).
Электронномикроскопические исследования показали, что сферопласты способны делиться, при чем механизм их деления иной, чем у исходных бактерий. У них наблюдается неравновеликое деление, при котором две дочернин клетки несколько различаются по размеру, а также почкование, т.е. отделение нескольких, реже одной дочерней клетки значительно меньше диаметром, чем материнская клетка. Иногда деление
12
происходит внутри пространства, ограниченного наружной мембраной (53, 54, 115). В процессе жизни сферопласты либо реверсируют в бактериальные клетки, либо трансформируются в Ь-формы; при прекращении действия индуцирующих факторов, быстро реверсируют в бактериальные формы, восстанавливая все свои биологические свойства (31, 77).
Протопласты - это шаровидные образования правильной округлой формы, в 3-10 раз превышающие по размерам клетки бактериальной популяции в Б-форме, при этом способные не только увеличиваться в размерах, но и делиться, с преобладанием неравновеликого деления с образованием перетяжки.
Общими свойствами протопластов и сферопластов является их способность к неравновеликому делению и почкованию. Они широко распространены как в природе, так и в организме животных и человека, однако их выделение затруднено, так как они имеют либо дефектность клеточной стенки, либо ее полное отсутствие, в результате чего не окрашиваются и не выявляются методами световой микроскопии (65, 77, 115,210).
Ь-фаза объединяет генетически не детерминированные и генетически детерминированные проявления роста бактерий, характеризующиеся общим Ь-фенотипом (незавершенные Ь-формы, нестабильные Ь-формы, условно стабильные Ь-формы, стабильные Ь-формы). Биологическое значение Ь-форм и их главное отличие от всех ранее рассматриваемых групп заключается в том, что они являются формой выживания и размножения микроорганизмов при отсутствии клеточной стенки.
Для Ь-форм характерны колонии, врастающие в питательный субстрат, способные проходить через бактериальные фильтры, благодаря особым способам репродукции. Изменение характера роста и обменных процессов по сравнению с исходными формами, способность к
- Київ+380960830922