Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий

2
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ...........................................................4
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................12
1.1 Биологическая роль лактобактерий..............................12
1.1.1. Иммуностимулирующая активность лактобактерий.........14
1.1.2. Лекарственные препараты и применение ИМП.............20
1.2. Способы получения микробных гидролизатов.....................24
1.3. Общая характеристика и методы анализа основных биологически активных веществ микробных гидролизатов...........................27
1.3.1. Общая характеристика и методы анализа белковых веществ,
входящих в состав микробных гидролизатов..........................27
ГЛАВА 2 РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ГИДРОЛИЗАТОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ..........................................................36
2.1. Разработка методики количественного определения общего белка 36
2.2. Разработка методики количественного определения общего содержания пептидов с молекулярной массой менее 1500.........................50
2.3. Разработка методики количественного определения общего содержания аминокислот.......................................................55
2.4. Разработка методики количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий методом капиллярного электрофореза.....................................................60
Выводы к главе 2..................................................78
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ................................79
3.1. Получение гидролизатов методом термокислотного гидролиза.....79
3.2. Получение гидролизагов методом ферментативного гидролиза.....84
3.3. Выбор оптимального консерванта...............................96
3.4. Разработка методики качественного и количественного определения
нипагина методом ВЭЖХ............................................102
Выводы к главе 3.................................................109
3
ГЛАВА 4. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
(«Биолактон»)....................................................110
4.1. Описание....................................................110
4.2. Сухой остаток...............................................110
4.3. Подлинность................................................1 11
4.4. Потенциометрическое определение раствора (рП)...............114
4.5. Номинальный объем...........................................115
4.6. Микробиологическая чистота..................................115
4.7. Количественное определение..................................118
4.8. Определение срока годности «Биолактона».....................132
Выводы к главе 4.................................................135
ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА «Биолактон».............................136
5.1. Методы исследования.........................................137
5.1.1. Моделирование интоксикации...........................137
5.1.2. Определение малонового диальдегида ТБК...............138
5.1.3. Определение активности лизоцима в сыворотки крови....139
5.1.4. Определение активности Р-лизинов в сыворотке крови...139
5.1.5. Определение БАСК.....................................139
5.1.6. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов крови....140
5.2. Результаты исследования.....................................140
5.2.1. Влияние курсового введения лекарственных препаратов на массу тела подопытных животных в условиях экспериментальной нормы и при интоксикации четыреххлористым углеродом..........................140
5.2.2. Изучение эффективности профилактического введения препаратов с целью коррекции нарушений, обусловленных интоксикацией
четыреххлористым углеродом.......................................143
Выводы к главе 5.................................................151
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.....................................................152
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................154
15
пробиотиками, содержащими лактобактерии, значительно отражается на ряде показателей иммунитета [36].
Представители рода Lactobacillus стимулируют подавленную иммунную систему и не влияют на иммунную систему, находящуюся в нормальном состоянии [32]. Они способны стимулировать систему перитонеальных макрофагов, активировать клетки и структуры, связанные с морфологическим субстратом клеточного иммунитета [33, 34]. Активируя ретикуло-эндотелиальную систему кишечного тракта и способствуя продукции ряда цитокинов, лактобактерии обеспечивают баланс между гуморальным и клеточно-опосредованным типами иммунного ответа. Кроме того, неоднократно отмечалась, что молочнокислые бактерии обладают противоопухолевой активностью [35-40].
Назначение детям с дефицитом секреторного иммуноглобулина А пробиотиков на основе молочнокислых бактерий способствует регуляции системы местного иммунитета [41].
В экспериментах, выполненных на лабораторных животных, было показано, что молочнокислые бактерии, такие как L. delbrueckii, L. acidophilus, L. casei, могут стимулировать иммунные реакции, включая фагоцитоз, активность натуральных киллеров и продукцию антителобразующих клеток у мышей [36].
Назначение ацилакта (бактерийного препарата, получаемого на основе 3 различных штаммов L. acidophilus) нормализовало микрофлору кишечника и корригировало нарушенное состояние иммунной системы, способствуя уменьшению проявлений пищевой аллергии. Ацилакт нормализовал исходно резко угнетенный иммунный ответ у детей, больных атопическим дерматитом, осложненным пиодермией. Показано, что лактобактерии стимулируют противоинфекционный иммунитет в эксперименте, а также вызывают стимуляцию иммунных реакций при остром ротавирусном гастроэнтерите у детей. У новорожденных, которым давали дважды в день на
16
протяжении 5 дней молочнокислые бактерии, уменьшалась длительность диареи и повышался уровень сывороточных IgA-антител к ротавирусу [36].
Наряду с усилением противоинфекционного иммунитета лактобактерии стимулируют и противоопухолевый иммунитет. Впервые противоопухолевое действие было показано И.Г. Богдановым и соавт. Авторы установили, что введение культуральных фильтратов L. delbrueckii subsp. Bulgaricus (LB 51) мышам с саркомой Крокера приводило к полному исчезновению опухоли у 59,3% животных. Аналогичные результаты были получены с карциномой Эрлиха после 4 инъекций культурального фильтрата L. bulgaricus: исчезновение опухоли наблюдалось у 45,6%
экспериментальных животных.
Противоопухолевое действие лактобактерий было показано in vivo на перевиваемых опухолях мышей (саркома 180, меланома, меланосаркома В-16, плазмоцитома MOPS 315, аденокарцинома ACATOL) [36].
Важнейшим механизмом взаимодействия представителей облигатной микрофлоры с организмом хозяина, направленным на поддержание гомеостаза, является стимуляция продукции ряда цитокинов. Цитокины являются медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, гемопоэзе и развитии воспаления, эффекторами некоторых реакций иммунитета и служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма.
Цитокины подразделяются на несколько групп: интерлейкины (ИЛ) -факторы взаимодействия между лейкоцитами; интерфероны (ИФН) -цитокины противовирусной активности; факторы некроза опухолей (ФИО) -цитокины с цитостатической активностью; колониестимулирующие факторы (КСФ) - гемопоэтические цитокины и хемокины (ХК) - хемотаксические цитокины [42 - 45].
Можно выделить 3 относительно автономных группы клеток -продуцентов цитокинов, отличающихся по характеру ответа на активирующее воздействие, набору продуцируемых ими цитокинов и тем