СОКРАЩЕНИЯ, НАИБОЛЕЕ ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЮЩИЕСЯ В ТЕКСТЕ:
СоОю - КОЭНЗИМ Ою, убихинон Со(^9 - КОЭНЗИМ СЬ
а-ТОС - а-токоферол
БАД - биологически активная добавка к пище
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭЖХ-ЭХ - высоэффективная жидкостная хроматография с электрохимическим детектированием
АФК - активные формы кислорода
ОН* - гидроксильный радикал
8НЯ - спонтанно гипертензивные крысы, крысы с наследственной артериальной гипертензией
8Н1*.8Р - спонтанно гипертензивные крысы с предрасположенностью к инсульту
2
СОДЕРЖАНИЕ
Введение............................................................... 6
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
История открытия и изучения коэнзима 0............................... 13
Биосинтез коэнзимов <?............................................... 14
Биохимические функции коэнзимов (3................................... 16
Физико-химические свойства КОЭНЗИМОВ 0............................... 16
Методы определения КОЭНЗИМОВ (3...................................... 18
Электрохимические методы...........................................18
Спектрофотометрическис методы..................................... 18
Хроматографические методы со спектрофотометрическим и
электрохимическим детектированием................................. 20
Высокоэффективная жидкостная хроматографии с масс-
спектрометрическим детектированием................................ 27
Способы пробоподготовки биологических объектов.................... 32
Сердечно-сосудистые заболевания и коэнзим <3ю........................ 34
Фармакокинетика коэнзима (310........................................ 38
Абсорбция и транспорт..............................................38
Эндогенные уровни в тканях........................................ 42
Захват коэнзима (310 тканями...................................... 45
Фармакокинетические параметры коэнзима (Зю........................ 48
И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1. Качественное и количественное определения коэнзимов О и а-токоферола в составе БАД н биоматериале с применением ВЭЖХ-ЭХ 52
1.1. Разработка ВЭЖХ-методики определения коэнзима (210 в составе БАД серии «Кудесан»: растворе «Кудесан», таблетках «Кудесан форте» и жевательных таблетках «Кудесан для детей».................... 53
1.2. Разработка ВЭЖХ-методики определения коэнзима (Зю, коэнзима СЬ
и а-токоферола в плазме крови, миокарде и головном мозге крыс... 58 %
1.3. Выводы....................................................... 66
з
Хроматографические методы со спсктрофотомстрнческим и электрохимическим детектированием
Неполярная природа убихинона и его гомологов обусловливает использование обращенио-фазового варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии [140]. В работе [14] показано, что данный метод существенно превосходит нормально-фазовый вариант по воспроизводимости и позволяет добиться большей селективности при совместном определении Со<Зю и его аналогов. Судя по литературным данным, наиболее часто применяют спектрофотометрическое и электрохимическое детектирование.
В работе [81] описан метод совместного определения ретинола, а-ТОС и коэнзима СоОю в плазме крови. Разделение проводили на колонке ЫСйгоБрИег 100 КР-18 (4x125 мм, размер зерна 5 мкм), используя в качестве подвижной фазы смесь метанола с гексаном в объемном соотношении 72:28. Детектирование осуществляли при длине волны 276 нм. Предел обнаружения убихинона составил 0,83 мкмоль/л.
В работе [43] предложен метод определения коэнзима (}ю в мышечной ткани и плазме с использованием в качестве внутреннего стандарта ди-пропокси-Со(2ю. К гомогенизированному образцу или плазме добавляли 50 мкп внутреннего стандарта и проводили экстракцию с последующей сменой растворителя. Убихиноны детектировали при 275 нм. Градуировочный график был линеен в интервале 10-1000 нмоль/л, предел обнаружения 6 нмоль/л.
Авторы работы [142] для экстракции жирорастворимых изопреноидных соединений из тканей мозга и печени проводили сапонификацию 15 М КОН в метаноле. В качестве неподвижной фазы использовали колонку ПИгасагЬ 5 008-20 фирмы РЬепошепех. Разделение осуществлялось в градиентном режиме в смеси вода:метанол:изопропанол. Данная методика позволяет наряду с другими компонентами определять коэнзимы (З9 и (Зю в интервале концентраций 1-60 мг/л.
Авторы работы [136] разработали методику определения убихинонов в биологических объектах, таких как плазма, моча и ткани органов. В качестве внутреннего стандарта использовали Со(Зц. Анализ проводили на колонке БтеРаск С18 (4,6x250 мм). В качестве подвижной фазы использовали смесь
20
метанола с гексаном (3:1). Спектрофотометрическое детектирование осуществляли при длине волны 275 нм. Предел обнаружения составил 10 нг.
Простой и достаточно экспрессный метод определения общего содержания CoQio в плазме описан в работе [125]. К 200 мкл плазмы добавляли 50 мкл раствора 1,4-бензохинона (2 мг/мл) для перевода убихинолов в окисленную форму, проводили реакцию в течение 10 минут и осаждали белки 1 мл н-пропанола. После центрифугирования надосадочную жидкость отбирали и вводили в хроматограф. Разделение проводили на колонке Supelcosil LC 18. Для изучения стабильности полученного раствора образцы хранили в течение трех суток при 25, 4 и -22°С. Было показано, что при этом суммарное содержание коэнзима в пробе не меняется. В случае спектрофогомегрического детектирования (275 нм) использовали подвижную фазу, состоящую из этанола и метанола (65:35). Для совместного определения окисленной и восстановленной формы использовали кулонометрический дегектор. Убихинон переводили в восстановленную форму, прикладывая к ячейке потенциал -500 мВ и в дальнейшем проводили определение при 350 мВ. Для обеспечения достаточной электропроводности раствора в подвижную фазу вводили 50 мМ перхлората натрия. Предел обнаружения при использовании кулономегрического детектора составил 5 мкг/л.
Авторам работы [172] удалось осуществить разделение окисленной и восстановленной форм C0Q9 и CoQio на обращеиио-фазовой колонке Microsorb-MV (4,6x150 мм, размер зерна 5 мкм). Подвижная фаза состояла из смеси безводного ацетата натрия (4,2 г), 15 мл уксусной кислоты, 15 мл изопропанола, 830 мл метанола и 140 мл гексана. Кулонометрическое детектирование осуществляли по следующей схеме: в предколоночной кондиционирующей ячейке проводилось окисление элекхроактивных компонентов элюента, затем, после разделения веществ на колонке, элюат поступал в дополнительную защитную ячейку с потенциалом электрода 0,7 В. После этого вещества попадали в аналитическую ячейку с двумя последовательными электродами. Потенциалы электродов устанавливали равными -1 и 0,45 В: При этом на. первом электроде, происходил предварительный перевод коэнзимов в восстановленную форму, а на втором осуществляли непосредственно детектирование. Для определения общей концентрации коэнзимов потенциал электрода в предколоночной ячейке
21
- Київ+380960830922