РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт досліджень. Виділення лімфоцитів
В наших дослідженнях моноядерні лімфоцити периферичної крові виділяли з
гепаринізованої свіжоотриманої крові клінічно здорових осіб віком 21-28 років,
розведеної розчином Хенкса без Са2+ і Mg 2+ у 3 рази. В пробірки 15х100 мм
наливали по 3 мл розчину фіколу-урографину (с=1,077 г/см3). За допомогою шприца
з довгою голкою кров (8 мл) нашаровували на ступеневий градієнт 9% фіколу в
урографині, після чого центрифугували 30 хв при 200 g. На межі розділу двох фаз
збирали прошарок лімфоцитів.
Для вивчення ферментативної активності лімфоцитарну суміш центрифугували 30 хв
при 800 g та відбирали надосадову рідину, а лімфоцити ресуспендували у
відповідній кількості 0,9% NaCl, що містив ЕДТА в кінцевій концентрації 0,1%.
Підраховували клітини у камері Горяєва, використовуючи як барвник 0,1%
трипановий синій. Життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах складала не
менше 95% оцінювали за забарвленням трипановим синім [8, 163].
Обрані для досліджень моноядерні лімфоцити периферичної крові людини
характеризуються низкою переваг, а саме: розмірами цих клітин (7-8 мкм),
кількістю, зручністю виділення. У роботі використані методи, які, на нашу
думку, дозволяють адекватно дослідити системи глутатіонового антиоксидантного
захисту та активного транспорту катіонів у цих клітинах.
2.2. Пермеабілізація клітин
Для розкриття глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної та Na+,K+-АТФазної
латентної активності до суспензії лімфоцитів додавали 0,2 % сапонін, а для
визначення глутатіонпероксидазної та Ca2+,Mg2+-АТФазної активності – 0,1%
сапонін. Дана методика грунтується на роботах Орлова та співавторів, виконаних
на еритроцитах [27, 73, 74].
2.3. Визначення глутатіонпероксидазної активності
Суть методу полягає у розвитку кольорової реакції з
5,5-дітіо-біс(2-нітро-бензойною кислотою (ДТНБК) з утворенням кольорового
продукту тіонітрофенільного аніону (ТНФА), кількість якого прямо пропорційна
кількості SH-груп, які прореагували з ДТНБК [95].
Для визначення глутатіонпероксидазної активності 0,1мл суспензії лімфоцитів
вносили в 0,8 мл інкубаційного середовища, яке готували на 0,1 М трис-HCl
буфері (рН 8,0) та містило 2 мМ ЕДТА, 12 мМ NaN3, 4,8 мМ GSH. Після 10 хв
інкубації при 370С додавали 100 мкл 20 мМ гідропероксиду третбутилу та
інкубували ще 30 хв. Реакцію зупиняли додаванням 0,2 мл 20% ТХО охолодженої.
Потім проби центрифугували 10 хв при 800 g. До 50 мкл супернатанту додавали 5
мл 0,1 М трис-HCl буферу, 50 мкл реактиву Елмана. В контрольні зразки 0,1 мл
гемолізату додавали після ТХО. Через 5 хв визначали оптичну густину проб на
спектрофотометрі СФ-46 при 412 нм в 1 см кюветі проти Н2О.
ГП-активність відображали в нмоль GSH/мг білка за 1 хв, враховуючи молярний
коефіцієнт екстинції тіонітрофенільного аніону (ТНФА) = 13,6 М-1·см-1
2.4. Визначення глутатіонредуктазної активності
Глутатіонредуктазну активність суспензії лімфоцитів визначали
спектрофотометрично при л=340 нм в 0,2 М калій-фосфатному буфері (рН 7,0), який
містив 2 мкM EDTA. На 1 мл об’єму кювети вносили 0,5 мл калій-фосфатного буферу
при 30?С; 50 мкл 2 мкM NADPH, приготовленого на 10 мкM трис-HCl буфері (pH
7,0); 50 мкл 20 мкM GSSG. До кінцевого об’єму доводили дистильованою водою.
Реакцію починали додаванням до кювети 100 мкл суспензії клітин. Час інкубації
становив 10 хв. Визначення проводились по зміні поглинання при 340 нм, 30 С?.
Як контроль використовували проби без NADPH, без GSSG та без субстрату.
ГР-активність відображали в нмоль NADPH/мг білка за 1 хв, враховуючи молярний
коефіцієнт екстинції NADPH = 6,22·103 М-1·см-1 [13, 169].
2.5. Визначення глутатіонтрансферазної активності
Глутатіонтрансферазну активність лімфоцитів визначали спектрофотометрично при л
= 340 нм в 0,1 М калій-фосфатному буфері (рН 6,5), що містив 1 мМ ЭДТА, 1 мМ
1-хлор-2,4-динітробензол, 5 мМ GSН. Суспензію клітин додавали до концентрації
0,4 мг белка на 1 мл реакціонного середовища. ГТ-активність розраховували на 1
мг білка та відображали в нмоль GSH/мг білка за 1 хв [13, 17, 20], враховуючи
молярний коефіцієнт екстинції 1-хлор-2,4-динитробензолу = 9,6?10-3 М-1 см-1.
2.6. Визначення вмісту відновленого глутатіону
Для дослідження вмісту відновленого глутатіону використовували інкубаційне
середовище при 370 С, що містило 200 мкл 1,5 мкМ DTNB у 0,1 M калій-фосфатному
буфері (рН=7,0), 200 мкл Н2Одист. В цю суміш вносили 100 мкл суспензії
лімфоцитів, перемішували скляною паличкою і через 10 хв визначали оптичну
густину при 412 нм. Кількість відновленого глутатіону відображали у нмолях
GSH/мг білка [13, 20].
2.7. Оцінка стану ПОЛ за визначенням концентрації МДА
Принцип методу визначення МДА полягає в тому, що при високій температурі в
кислому середовищі він реагує з 2-тіобарбіртуровою кислотою, створюючи
забарвлений триметиленовий комплекс з максимумом поглинання при 532 нм [98].
Для кількісного вмісту МДА до 0,2 мл суспензії клітин додавали 3,0 мл
дистильованої води, 0,5 мл KMgO4, перемішуючи суміш за допомогою скляної
палички. Через 10 хв, додавали 0,5 мл FeSO4, цю процедуру повторювали 2 рази.
Пробірки закривали гумовими корками з фольгою. Через 5 хв, реакцію зупиняли
додаванням 1 мл 20% розчину ТХО.
Після центрифугування протягом 15 хв при 200 g надосадкову рідину по 2 мл
переносили в пробірки, додавали по 0,5 мл розчину HCl, 1 мл 0,8% розчину
тіобарбітурової кислоти і розміщували на 20 хв в киплячу водяну баню. Як
контроль використовували проби, що містили 2 мл дистильованої води.
Після появи рожевого забарвлення проби
- Київ+380960830922