РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования
В настоящей работе использовали 350 половозрелых крыс-самцов линии Вистар массой 150 - 200 г, которых содержали в виварии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина. Объектом исследования были печень, почки, селезенка и кровь животных. Животные были разделены на группы в зависимости от задач эксперимента.
1. Контрольные животные, которым вводили соответствующий объем физиологического раствора.
2. Животные, которым подкожно вводили CdCl2?2,5H2O (0,28% раствор в 0,9% NaCl) в дозе 1,4 мг на 100 г массы тела [201]. Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после введения хлорида кадмия.
3. Животные, которым внутрибрюшинно вводили HgCl2 (0,1% раствор в 0,9% NaCl) в дозе 0,7 мг на 100 массы тела [155]. Крыс брали в опыт через 2 ч или 24 ч после введения хлорида ртути.
4. Животные, которым подкожно вводили CoCl2?6H2O (0,6% раствор в 0,9% NaCl) в дозе 3 мг на 100 г массы тела [18]. Крыс брали в опыт через 2, 6 и 24 ч после введения хлорида кобальта.
5. Животные, которым вводили фенилгидразин (1,4% раствор в 0,9% NaCl) в дозе 7 мг на 100 г массы тела [200]. Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после введения фенилгидразина.
6. Животные, которым вводили глицерол (50% водный раствор) в дозе 0,75 мл на 100 г массы тела внутримышечно по 0,5 дозы в каждую переднюю бедренную мышцу [187]. Животных брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после инъекции глицерола.
7. Животные, которым внутримышечно вводили ?-токоферол (в форме ацетата, аптечный препарат) в дозе 5 мг на 100 г массы тела [202]. Крыс брали в опыт через 4 ч или 26 ч после введения ?-токоферола.
8. Животные, которым внутрибрюшинно вводили билирубин (навеску билирубина растворяли в 1N NaOH и доводили до нужного объема 0,9% NaCl) в дозе 2,3 мг на 100 г массы тела [203]. Крыс брали в опыт через 4 ч или 26 ч после введения билирубина.
9. Животные, которым за 2 ч до введения CdCl2, HgCl2, или CoCl2 внутримышечно вводили ?-токоферол (в указанных выше дозах) и брали в опыт через 2 ч и 24 ч после введения солей металлов.
10. Животные, которым за 2 ч до введения HgCl2, или CoCl2 внутрибрюшинно вводили билирубин (в указанных выше дозах) и брали в опыт через 2 ч и 24 ч после введения солей металлов.
11. Животные, которым за 0,5 ч до введения глицерола внутрибрюшинно вводили циклогексимид (0,06% раствор в 0,9% NaCl) в дозе 20 мкг/100 г [204]. Крыс брали в опыт через 2 ч после введения глицерола.
Обычно, за 12-14 ч до опыта животных лишали корма без ограничения в питьевой воде. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом.
Кровь собирали в сухие пробирки для получения сыворотки. Пробирки помещали в термостат на 0,5 ч. Сыворотку отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин [205].
Печень перфузировали холодным 0,9 % физиологическим раствором in situ через воротную вену. Печень, почки и селезенку быстро извлекали и помещали в стаканчики с ледяным 0,9 % физиологическим раствором.
Все операции проводились на холоду.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод определения гемоксигеназной активности. Гемоксигеназную активность определяли в 25% гомогенате печени или селезенки и 33% гомогенате почек крыс методом дифференциальной спектрофотометрии как описано в работах [206,207]. Навеску печени или селезенки 1 г или навеску почек 1,5 г продавливали через пресс и гомогенизировали в 3 мл среды выделения в течение 15 - 20 с в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (скорость вращения - 600 об/мин, зазор стекло - тефлон 0,2 мм). Средой выделения для всех органов служил 0,1М Na+,К+ - фостатный буфер рН - 7,45. Гомогенат фильтровали через 2 слоя неокрашенной капроновой ткани.
Метод определения гемоксигеназной активности основан на измерении образовавшегося билирубина в системе, содержащей источник ферментов (гомогенат и цитозоль) и субстрат - гемин и НАДФН. В состав инкубационный среды входили следующие компоненты: 0,06 - 0,08 мл гомогената печени или почек (содержание белка в кювете - 2 мг) или 0,03 - 0,05 мл гомогената селезенки (содержание белка в кювете - 1 мг); 0,05 мл 105000g супернатантной фракции гомогената печени интактных крыс (40 мг белка в 1 мл), в качестве источника биливердинредуктазы; 0,05 мл гемальбумина (151мкМ бычий сывороточный альбумин + 2мМ гемин); 0,1М Na+,К+ - фостатный буфер рН - 7,45 до конечного объема 1,4 мл.
Пробы помещали в термостатированную мешалку, после 1 минутной преинкубации при t=370 в опытные пробы добавляли по 0,1 мл 2мМ раствора НАДФН, а в контрольную - 0,1 мл 0,1М Na+,К+ - фостатного буфера, рН - 7,45. Далее пробы инкубировали 10 мин при t=370. Через 10 мин реакцию останавливали, помещая инкубационные сосуды на лед. Пробы закрывали темной крышкой.
Спектр поглощения билирубина записывали на двулучевом регистрирующем спектрофотометре Spekord UV VIS фирмы Carl Zeiss, Jena (ГДР), измеряя разность экстинций при 464 и 530 нМ. Активность фермента рассчитывали по количеству образовавшегося билирубина с использованием коэффициента экстинции 40?мМ-1см-1 и выражали в нмоль билирубина на 1 мг белка за 1 минуту [207].
2.2.2. Выделение митохондрий и микросом из печени и почек крыс. Навеску печени или почек 2 г продавливали через пресс и гомогенизировали в 10 мл среды выделения на холоду в течение 20-30 с в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (скорость вращения - 600 об/мин, зазор стекло - тефлон 0,2 мм). Среда выделения содержала: 0,3М сахарозу, 1мМ трилон Б, 10мМ трис-HCl, pH 7,4 [208]. Полученный гомогенат центрифугировали при 600g в течение 10 мин в рефрижераторной центрифуге ЦЛР-1. Супернатант центрифугировали 20 мин при 10000g. Полученный осадок митохондрий суспендировали в 5 мл среды промывания (100мМ трис-HCL буфер, рН 7,4) [208] и центрифугировали 10 мин при 10000g. Осадок митохондрий суспендировали в 0,5 мл среды промывания и использовали для определения общего гема митохондрий.
Постмитохондриальную фракц