Розділ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Хімічні реактиви
Для приготування розчинів використовували хімічні реактиви фірм: Sigma (США), Roche (Франція), Merck (Німеччина), Qiagen (Німеччина), а також вітчизняні реактиви класів "чда" та "осч".
Ферменти рестрикції та реактиви для полімеразної ланцюгової реакції одержані від компаній New England Biolabs (США), Promega (США), Gibco BRL (Франція), Fermentas (Литва).
Компоненти середовищ для культивування бактеріальних та дріжджових клітин від компанії Difco (США) та Q-bio (Франція).
Реагенти для проведення електрофорезу білків та нуклеїнових кислот від BioRad (США).
В роботі використовували набори для виділення плазмідної ДНК та фрагментів нуклеїнових кислот з агарозного гелю від Qiagen (Німеччина) та Genomed (Франція). Набори для вимірювання концентрації білку - BioRad (США). Набори для детекції хемілюмінесценції - ЕCL kit, Pierce (Англія).
Лабораторний пластик від компаній Eppendorf (Німеччина), Falcon (США), Sarstedt (США), Nunc (США).
Всі розчини готувались на ультра чистій воді, підготовленій за допомогою системи фільтрації MilliQ plus, Millipore.
2.2. Поживні середовища
LB (повноцінне середовище для вирощування E. coli):
на 1 л брали 10 г бакто-триптону, 5 г дріжджового екстракту, 10 г NaCl, доводили рН до 7,5. Також готували LB агар, для чого до 1 л рідкого середовища LB додавали 15 г агару. Для селекції бактеріальних штамів до поживного середовища додавали антибіотики ампіцілін чи канаміцин. Кінцева концентрація ампіціліну - 100мкг/мл, канаміцину - 50мкг/мл.
YPD (повноцінне середовище для вирощування S. cerevisiae):
на 1 л брали 20 г бакто-пептону, 10 г дріжджового екстракту, 20 г глюкози. Також готували YPD агар, для чого до 1 л рідкого середовища YPD додавали 20 г агару.
SD (мінімальне середовище для вирощування S. cerevisiae):
на 1 л брали 6,7 г YNB, 20 г глюкози. Також готували SD агар, для чого до 1л рідкого середовища SD додавали 20 г агару.
SMM-Trp (доповнене мінімальне середовище для селекції S. cerevisiae):
на 1 л середовища SD додавали 1,92 г DOM-Trp (сухої поживної суміші без триптофану).
SMM-Leu (доповнене мінімальне середовище для селекції S. cerevisiae):
на 1 л середовища SD додавали 1,6 г DOM-Leu (сухої поживної суміші без лейцину).
SMM-Ura (доповнене мінімальне середовище для селекції S. cerevisiae):
на 1 л середовища SD додавали 1,92 г DOM-Ura (сухої поживної суміші без урацилу).
Всі поживні середовища стерилізувались у автоклаві на протязі 15хв. при температурі 1200С та тиску 1 атм.
2.3. Буферні розчини
Буфер для електрофорезу нуклеїнових кислот (електродний) містив 40мМ трис-ацетат, рН 8,3; 1мМ ЕДТА;
Буфер зразків для електрофорезу в агарозному гелі (6х) містив 0,25% бромфеноловий синій, 0,25% ксиленціанол, 30% гліцерол;
Буфери для виділення плазмідної ДНК:
Р1 - 50мМ трис-HCl, рН 8,0; 10мМ ЕДТА; 100 мкг/мл РНКази А;
Р2 - 200мМ NaOH; 1% ДСН;
Р3 - 3М СН3СООК, рН 5,5;
Буфер для електрофорезу білків (електродний) містив 25мМ трис, 250мМ гліцин, 0,1% ДСН;
Буфер зразків для електрофорезу білків в ПААГ містив 50мМ трис-HCl, рН 6,8, 100мМ ДТТ, 2% ДСН, 0,1% бромфеноловий синій, 10% гліцерол;
Буфери для виділення та очистки рекомбінантних білків на Ni-NTA агарозі (в денатуруючих умовах):
Буфер для лізису клітин - 8М сечовина, 0,1М NaН2РО4, 0,01М трис-HCl, рН 8,0;
Буфер для відмивання - 8М сечовина, 0,1М NaН2РО4, 0,01М трис-HCl, рН 6,4;
Буфер для елюції - 8М сечовина, 0,1М NaН2РО4, 0,01М трис-HCl, рН 4,5;
Буфер для переносу білків на нітроцелюлозну мембрану (Трансфер-буфер) - 25мМ трис, 150мМ гліцин, 0,1% ДСН, 20% етанол;
Розчини для ІФА та Вестерн-блот аналізу:
Буфер для сорбції на 1л містив 1,59г Na2CO3 та 2,93г NaHCO3, рН 9,6;
Буфер для розведення зразків - 20мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,5М NaCl, 0,05% Tween-20, 10% сухе знежирене молоко;
Буфер для відмивання планшет - 20мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,5М NaCl, 0,05% Tween-20;
RIPA буфер для приготування білкового екстракту з дріжджових клітин:
150мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% DOC, 0,1% ДСН та 50мМ Трис-HCl, pH8,0.
Розчини для трансформації бактерій:
Розчин А - 10мМ MgSО4, 0,2% глюкоза на LB середовищі.
Розчин В - 36% гліцерол, 12% ПЕГ 10000, 12мМ MgSО4 на LB середовищі.
Розчини для трансформації дріжджів:
LiTE - 0,1М Літію ацетату, 10мМ трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЕДТА;
ПЕГ/LiAc - розчин LiTE з вмістом 40% ПЕГ-4000;
Буфер для вимірювання активності ?-галактозидази (Z-буфер) на 1л містив 16,1г Na2HPO4, 5,5г NaH2PO4, 0,75г KCl, 0,246г MgSO4, рН 7,0.
2.4. Олігонуклеотидні праймери
Олігонуклеотидні праймери, які використовували в роботі, синтезовані компанією MWG-Biotech AG (Німеччина). Послідовності олігонуклеотидів та їх призначення представлені в табл.2.1.
Таблиця 2.1
Олігонуклеотидні праймери
НазваНуклеотидна послідовність, 5?>3?ПризначенняAMVCP1ATCCCCGCTAGCTCTTCACAAAAGКлонування гену БО ВМЛ у вектор рЕТ24-аAMVCP2 ACCACCCCTCGAGTCCATGACGATCAAGТ7РТААTACGACTCACTATAGСеквінування гену БО ВМЛ у складі вектора рЕТ24-аT7TCTAGTTATTGTCCAGCGGTHCPFCAATAACCATGGGTTCTTCACAAAAGAAAGКлонування гену БО ВМЛ у вектори pACTII та pAS2THCPRCAATAACTCGAGTCGTCAATGACGATCAAGAMV1TGAGTTCTTCACAAAAGAAАналіз позитивних клонів (СР+) у ПЛРAMV2GGTAAATCAATGACGATCAA3HseqAGGTACGCTGTGGTGCTCGCTGСеквінування гену БО ВМЛ у складі вектора рIIIA/MS2-13HseqBCGATCCTCTAGAGTCGACCTGCPEcoRICCGGAATTCAGTTCTTCACAAAAGAAКлонування гену БО ВМЛ у вектор pGBT9CPPstIAACTGCAGGGTAAATCAATGACGATCAAPASAGCGACATCATCATCGGAСеквінування гену БО ВМЛ у складі вектора pAS2
2.5. Плазмідні вектори та генетичні конструкції
Плазмідні вектори та генетичні конструкції, які використовували в роботі представлені в табл.2.2.
Таблиця 2.2
Плазмідні ве