РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА
2.1 Виділення ізольованих міоцитів
Дослідження проводили на поодиноких гладеньком’язових клітинах, ізольованих з
поздовжнього шару середньої частини ileum морської свинки. Поодинокі
свіжоізольовані ГМК виділялися методом ферментативно-механічної обробки. У
дослідах використовувалися тварини вагою 350-450 г. Після препарування тварини,
отримані гладеньком`язові смужки поміщалися у розчин Б, де розрізалися на
фрагменти довжиною 2-3мм, а потім переносилися в безкальцієвий розчин В.
Ферментативна обробка гладеньком’язових смужок здійснювалася при температурі
36С0 у безкальцієвому розчині В в присутності: коллагенази тип 1A-(1мг/мл) ,
бичачого сивороткового альбуміну - (1 мг/мл), інгібітора трипсину – (1 мг/мл)
на протязі 22-26 хвилин. Після ферментативної обробки поодинокі ГМК виділяли
шляхом піпетування фрагментів тканини у безкальцієвому розчині В. Ізольовані
ГМК зберігалися у розчині Кребса(Б) при температурі 4С0 на протязі всього
експерименту.
2.2 Електричні вимірювання
Для вимірювання трансмембранних іонних струмів ізольованих гладеньком’язових
клітин було використано методику фіксації потенціалу (“patch-clamp”).
У дослідах використовувалися боросілікатні скляні піпетки, що після заповнення
відповідним розчином Г* мали опір 3-6 МОм. Іонні струми реєструвалися за
допомогою підсилювача фіксації потенціалу List EPC-5 (List Electronics,
Germany) або Axopatch 200В (Axon Instruments, США). Для генерації імпульсів
напруги, а також для реєстрації іонних струмів поодиноких катіонних каналів
використовувалися DigiData1200 та програма pClamp 6 (Axon Instruments, Inc.,
США). Аналіз кинетико-амплітудних характеристик інтегральних трансмембранних
струмів та поодиноких катіонних каналів проводився за допомогою програм pClamp
8 і MicroCal Origin 5.5 (MicroCal Software, США).
Розчини в робочій камері (об’єм якої складав 500 мкл) під час експерименту
замінювалися поступово, повна заміна досягалася через – 4-8 секунд після
початку відмиву. Досліди проводились при кімнатній температурі (22-24 оС).
2.2.1. Дослідження інтегральних іонних струмів.
Для дослідження інтегральних іонних струмів від мембрани цілої клітини
використовували “whole-cell” конфігурацію методу “patch-clamp” (дивитись Рис.
2.1), її принцип полягає в утворенні щільного (гігаомного) контакту між
стінками піпетки і мембраною клітини (конфігурація “cell-attached”)[48,51]. На
наступному етапі ділянку мембрани під піпеткою руйнували поштовхом від’ємного
тиску, що забезпечувало доступ вмісту піпетки до цитоплазми клітини. В
результаті дифузії відбувається заміна іонного складу внутрішньоклітинного
середовища розчином з піпетки. Прорив мембрани під піпеткою призводив до
виникнення низькоомного контакту між внутрішньоклітинним вмістом і піпеточним
розчином. Інтегральна площа ємністних артефактів струму при
гіперполяризаційному стимулі 5 мВ використовувалась для подальшої оцінки
ємності ГМК. Іонний склад основних розчинів, використаних для дослідження
інтегральних іонних струмів представлений у таблиці 1.
Реєстрація струмів поодиноких катіонних каналів.
Реєстрацію активності поодиноких неселективних катіонних каналів здійснювали
за допомогою методу “patch-clamp” у двох основних конфігураціях outside-out та
cell-attached. Процедура отримання потрібних конфігурацій зображена на
Рис.2.1.
При використанні конфігурації “cell-attached” виникає ряд проблем, пов’язаних
з відсутністю контакту з цитоплазмою клітини. Перш за все, це проблема
визначення реальних значень фіксованого потенціалу. Це пов’язано з тим, що при
використанні такої конфігурації фіксований потенціал дорівнює сумі потенціалу
спокою клітини і командного потенціалу. Потенціал спокою в експерименті
зазвичай не контролюється, що може зумовити досить значні похибки в визначенні
його справжнього значення. Струми, що реєструються в конфігурації
“cell-attached” мають напрямок протилежний напрямку струмів в реальних умовах.
Відповідно, потенціал фіксації ділянки мембрани дорівнює протилежному, що
встановлюється на внутрішній стороні мембрани.
Рис. 2.1. Варіанти методу фіксації потенціалу на мембрані клітини за допомогою
мікропіпетки, що присмоктується (“patch-clamp”).
Рис. 2.1. Варіанти методу фіксації потенціалу на мембрані клітини за допомогою
мікропіпетки, що присмоктується (“patch-clamp”).
А. Контакт мембрани з піпеткою.
Б. “cell-attached” конфігурація методу “patch-clamp”.
В. “perforated-patch” “patch-clamp”
Г. “whole-cell” “patch-clamp”
Д. “inside-out” “patch-clamp”
Е. “outside-out” “patch-clamp”
Амплітудно кінетичні характеристики поодиноких катіонних каналів реєстрували
та аналізували з використанням методів статистичного аналізу докладних опис
яких проводиться у наступному розділі .
2.3. Статистичні методи аналізу роботи поодиноких катіонних каналів
Відкривання катіонних каналів - це стохастичний процес, який призводить до
виникнення стрибків струму між сталими рівнями, що відповідають певним
величинам провідності каналу. Для більшості катіонних каналів стаціонарні рівні
провідності відповідають двом можливим станам - відкритому (коли через канал
проходить струм певної фіксованої амплітуди) та закритому (коли струм не
проходить) . Однак деякі типи катіонних каналів мають проміжні рівні
провідності. У таких випадках кажуть про наявність у каналі підрівнів
провідності.
Функції катіонного каналу можуть бути характеризовані такими параметрами, як
амплітуда струму (А) та тривалість перебування каналу на стаціонарних рівнях.
На рис.2.2. представлений фрагмент реєстрації струму через поодинокий катіонний
канал, що