РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Об'єкт дослідження
Для вивчення вікових змін ультраструктури й активності ЛФ, 5'- нуклеотидази і
Са2+- АТФази в МЦР БК був узятий біопсійний матеріал у МС. Біопсійний матеріал
для дослідження ультраструктури МЦР БК у людей, що не хворіють на ЦД I і II
типу (група порівняння) був узятий під час операції з приводу травматичної та
вікової катаракти. У людей, що хворіють на ЦД I і II типу, для
ультраструктурного дослідження, МЦР і ультрацитохімічного дослідження
активності ЛФ у стінці капілярів біопсійний матеріал брався під час операції з
приводу діабетичної катаракти*. Всім хворим, відібраним у групу порівняння,
попередньо проводилась біомикроскопія судин БК. У дослідження не включалися
особи з перенесеними в минулому захворюваннями роговиці і судинного тракту. У
всіх хворих на ЦД був компенсований рівень вуглеводнів у крові. Кількість людей
у який було проведене взяття біопсій і розподіл їх по вікових групах приведена
в таблиці 2.1.
Біопсійний матеріал БК ока МС забирався у тварин віком 6 місяців і 30 місяців
(по 14 – в кожній віковій групі).
_______________________________________________________________
*Екстракцію травматичної, вікової і діабетичної катаракти проводив доцент,
доктор медичних наук кафедри очних хвороб Національного медичного університету
імені академіка А.А.Богомольца Скрипник Р.Л.
Таблиця 2.1.
Розподіл біопсій бульбарної кон’юнктиви людини по віковим групам
Вік, роки
Катаракта (травматична чи вікова)
n
Цукровий діабет
I типу
n
II типу
n
20-29
5
3
______
30-39
5
3
______
40-49
5
2
2
50-59
5
5
5
60-69
7
5
7
70-79
6
______
5
80-89
4
______
1
Всього: 75
2.2. Метод обробки зразків тканин для електронно-мікроскопічних досліджень
Під час операції біопсійний матеріал БК людини занурювали в розчин для
фіксації.
У МС біопсію брали після тіопентал-натрієвої анастезії з розрахунку 100мг/кг
[46] і занурювали у фіксатор.
При фіксації біопсійного матеріалу БК людини і МС використовували 25%-й
глютаральдегід фірми "MERKER" (ФРН), розбавляючи його до 2,5% за допомогою 0,1
М фосфатного буфера рН - 7,4. Цей розчин двічі змінювався в процесі фіксації
через 1 годину. Для наступної фіксації використовувався 1%-й розчин осмієвої
кислоти [167]. Обезводнювання і заливку в смолу проводили згідно з
загальноприйнятою методикою. Збезводнені шматочки тканини занурювали в суміш
эпона-812, аралдита і DDSA [11, 210].
Отримані блоки зі шматочками тканини БК були оброблені під бінокулярною лупою
ультратому лезом безпечної бритви таким чином, що на поверхні блока утворилася
площадка без шару смоли з боків шматочка тканини. Блоки зі шматочками тканини,
на яких були поставлені гістохімічні реакції, оброблялися під бінокулярною
лупою так, щоб із двох сторін пірамідки перед шматочком тканини знаходився шар
смоли. У зв’язку з тим що, ціллю нашої роботи було вивчення капілярів БК на
ультратонких зрізах, нами попередньо проводилося прицільне ультратомування. Для
цього, отримані на ультратомі з блоків напівтонкі зрізи (0,5-1,0 мк )
розміщували на предметному склі в краплі 5% водного розчину ацетону і
висушували. Потім проводилося фарбування напівтонких зрізів по методу [175]*.
Після фарбування напівтонкі зрізи вивчали під світловим мікроскопом, потім на
блоці вирізалася ділянка шматочка тканини, що містила саму велику кількість
капілярів, і могла б бути по своїм розмірам придатною для одержання
ультратонких зрізів.
Ультратонкі зрізи товщиною 40-50 нм виготовляли на ультратомі LKB - III
(Швеція) за допомогою скляних ножів. Товщину зрізів визначали по кольору
інтерференційних стрічок [210]. Сріблясті зрізи виловлювали з ванночки і
розміщували на металевих сітках, що попередньо очищали в парах суміші
хлороформу і дихлоретану (1:3).
Для оглядової електронної мікроскопії контрастування ультратонких зрізів,
проводилося за допомогою 2%-ного розчину уранілацетату по [205] і цитрату
свинцю [177]. Ультратонкі зрізи, отримані зі шматочків тканини, на яких
проводилися цитохімічні реакції, не контрастували.
Ультратонкі зрізи досліджували за допомогою електронного мікроскопу SELMI.
Фотографування зображення проводилося на особливоконтрастні діапозитивні
фотопластинки (світлочутливість по ДСТ - 2,4 ОД) і на
____________________________________________________________________
* Рецептура розчину барвника: рівні частини 1% водного розчину метиленового
синього і 1% водного розчину тетраборнокислого натрію.
особочутливу діапозитивну фотоплівку ПФМ- 3л (світлочутливість по ДСТ - 0,9
ОД). Правильність значень, збільшення на електронному мікроскопі, контролювали
за допомогою тест-решітки, що має 1152 ліній на 1 мм.
2.3. Принципи і методи ультрацитохімічного виявлення лужної фосфатази, 5'-
нуклеотидази, Са2+ -АТФази
Фіксацію і подальшу обробку матеріалу для ультрацитохімічних
досліджень ЛФ, 5'- нуклеотидази здійснювали згідно методів, розроблених Гоморі
і модифікованих Бухваловим [15], а для виявлення Са2+- АТФази використовувався
метод, розроблений Ando [117].
ЛФ і 5'- нуклеотидаза (гідролази фосфомоноефірів) каталізують реакцію
гідролітичного розщеплення:
OH
I
R-O-P = HOH > ROH+H3PO4
I
OH
де R - спиртовий або фенольний радикал.
ЛФ - неспецифічна гідролаза, що каталізує перенос фосфорильного залишку в
реакціях гідролізу і трансфосфорилювання, а 5`-нуклеотидаза каталізує
н
- Київ+380960830922