РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи дослідження
2.1. Реактиви
У роботі були використані:
- Препарат "Омез для ін'єкцій" "Д-р Редді'с Лабораторіс Лтд", Індія;
- Стандартні набори для визначення активності тирозинових протеїнкіназ та тирозинових протеїнфосфатаз; антифосфотирозинові моноклональні антитіла, кон'юговані з пероксидазою хрону; УДФ-глюкоза; глюкозо-1,6-дифосфат; УДФ-глюкозо-пірофосфорилаза (печінка бика); фосфоглюкомутаза (м'язи кроля); глюкозо-6-фосфат-дегідрогеназа (дріжджі); НЕРЕS; Трис; дитіотриетол; ЕДТА; бичачий сироватковий альбумін (BSA) ("Sigma", США);
- Нітроцелюлозні фільтри, фільтрувальний папір FN 1, 2, 16 ("Filtrak", Німеччина);
- Fast Blue BB Salt ("Fluka", США);
- Решта реактивів кваліфікації х.ч. і ч.д.а. (вітчизняного виробництва).
2.2. Умови проведення експерименту
У дослідах використовували самців білих нелінійних щурів масою 200-250 г. Експериментальну виразку шлунка у піддослідних тварин викликали згідно методу [91] за допомогою холодового стресу. Модель стрес-індукованих виразкових уражень шлунка створювали витримуванням імобілізованих тварин 3,5 год за температури 4?С. За добу до проведення дослідів тварин не годували та давали воду ad libitum. Розчин препарату омепразолу у фізіологічному розчині для ін'єкцій вводили внутрішньочеревно у дозі 0,8 мг/кг один раз на добу відразу після стресового впливу та протягом 1-5 діб. Тварин декапітували через 40 хв після введення препарату (період напіврозпаду омепразолу) та виділяли слизову оболонку шлунка.
2.3. Проведення гістологічних досліджень слизової оболонки шлунка
Гістологічні дослідження слизової оболонки шлунка проводили за загальноприйнятою процедурою згідно методу [196].
2.4. Отримання препаратів плазматичних мембран та цитозолю клітин слизової оболонки шлунка
Ізольовану слизову оболонку шлунка гомогенізували у середовищі 0,14 М NaCl у гомогенізаторі з тефлоновим пестиком. Гомогенат центрифугували (20000g; 30 хв) для видалення ядер, мітохондрій та везикул апарату Гольджі. Осад відкидали, а супернатант використовували для отриманя плазматичних мембран та цитозолю за методом [197] центрифугуванням на 30% сахарозному градієнті (густина 1,127). Всі процедури виділення проводили за температури 4?С.
2.5. Визначення тирозинпротеїнкіназної активності в плазматичних мембранах та цитозолі клітин слизової оболонки шлунка
Тирозинпротеїнкіназну активність визначали методом імунно-ферментного аналізу з використанням наборів реактивів "Sigma", США.
У лунки мікропланшета вносили по 125 мкл тирозинпротеїнкіназного субстрату, poly-Glu-Tyr, у складі якого є тирозинові залишки, що можуть бути фосфорильованими тирозиновими протеїнкіназами. Інкубували 12 год при 37?С. Видаляли зайвий розчин і відмивали кожну лунку 200 мкл буферу для відмивки, який містив 10 мМ фосфатний буфер (рН 7,4) та 0,05% Tween-20. Видаляли розчин та висушували планшет протягом 2 год при 37?С. Вносили у всі лунки по 90 мкл інкубаційного середовища, що містило: 50 мM HEPES (pH 7,4), 20 мM MgCl2, 0,1 мM MnCl2 and 0,2 мM Na3VO4 та 35 нМ АТФ. Реакцію фосфорилювання ініціювали додаючи до середовища інкубації 20 мкл джерела ферментативного білку (отримані фракції цитозолю та плазматичних мембран з гомогенату слизової оболонки шлунка) та витримували 30 хв за кімнатної температури. Видаляли розчин та відмивали лунки буфером для відмивки п'ять разів. Потім вносили моноклональні фосфотирозинові антитіла, кон'юговані з пероксидазою хрону у розведенні 1:10000 по 100 мкл у кожну лунку та залишали за кімнатної температури. Через 30 хв розчин антитіл видаляли та промивали п'ять разів буфером для відмивки. Далі додавали по 100 мкл розчину хромогенного пероксидазного субстрату, який готували безпосередньо перед внесенням у лунки. Суміш витримували у темряві за кімнатної температури рівно 7 хв до розвитку жовтого забарвлення. Зупиняли реакцію додаванням 100 мкл 2,5 н Н2SO4. Вимірювання проводили на ELISA-рідері фірми Termo Labsystems OpsisMR з програмним забезпеченням Dynex Revelation Quicklik (США) при довжині хвилі 492 нм.
Тирозинпротеїнкіназну активність обраховували, використовуючи стандарт - очищений рецептор епідермального фактора росту, що мав відому ТПК-азну активність, та виражали у пмоль Фн на мг білка за 1 хв. Кількість білка визначали за методом Бредфорда [198].
2.6. Визначення тирозинпротеїнфосфатазної активності в плазматичних мембранах та цитозолі клітин слизової оболонки шлунка
Тирозинпротеїнфосфатазну активність визначали за допомогою колориметричного методу, який базується на визначенні кількості неорганічного фосфату, що утворюється в результаті реакції дефосфорилювання фосфорильованих по тирозинових залишках білкових субстратів та формує забарвлений комплекс з малахітовим зеленим і молібдатом амонію. У лунки мікропланшета вносили 10 мкл реакційного середовища, до складу якого входило: 250 мМ HEPES (pH 7,1), 750 мM NaCl, 50 мМ дитіотриетол, 10 мМ ЕДTА та 500 мкг/мл BSA, приготовані на дистильованій воді, що була очищена від фосфатів; 10 мкл розчину фосфорильованого тирозинпротеїнфосфатазного субстрату. Реакцію дефосфорилювання ініціювали додаванням 30 мкл джерела ферментативного білку. При цьому в контрольну лунку замість білку вносили 30 мкл 0,14 М NaCl. Інкубували 30 хв при 30?С. До реакційної суміші додавали 50 мкл розчину барвника малахітового зеленого з молібдатом амонію та витримували 10 хв за кімнатної температури для розвитку яскраво-зеленого забарвлення. Всі розчини реактивів готували безпосередньо перед використанням. Вимірювання проводили при довжині хвилі 620 нм.
Тирозинпротеїнфосфатазну активність обраховували за калібрувальною кривою (побудованою з використанням стандартних розчинів РО4-) та виражали у пмоль Фн на мг білка за 1 хв.
2.7. Визначення вмісту фосфотирозину в білках плазматичних мембран та цитозолю клітин слизової оболонки ш