РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана відповідно до державних і відомчих планів наукових досліджень у лабораторіях вивчення хвороб молодняку та вивчення вірусних хвороб рогатої худоби Національного наукового центру "Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини", а також у дослідному господарстві "Українка Слобідська" та СВК "Заповіт Леніна" Харківської області впродовж 2000 - 2007 років. Окремі етапи цих досліджень, зокрема біохімічні, проведено разом з науковими співробітниками лабораторії біохімії.
2.1. Віруси
Для розробки, виробництва та випробування живої вакцини проти вірусної діареї використали три штами: епізоотичний 25, еталонний Oregon C24V і виробничий ВК-1М вірусу діареї з колекції лабораторії вірусних хвороб рогатої худоби.
Виробничий штам ВК-1М вірусу діареї отриманий Стеценком В.І. в лабораторії вивчення вірусних хвороб рогатої худоби шляхом адаптації до розмноження епізоотичного ізоляту ВК-1, що був виділений у 1972 році від хворої на вірусну діарею ВРХ, і подальшої його атенуації шляхом серійних пасажів у культурах перещеплюваних клітин. Титр його інфекційності після 20 і 30 послідовних пасажів у перещеплюваних клітинах ПТ і ПО відповідно становив 6,5 і 6,8 lg ТЦД 50/см3. Титр інфекційності штамів 25 та Oregon C 24 V під час культивування в цих культурах становив 6,0 і 5,8 lg ТЦД 50/см3 та 6,2 і 6,0 lg ТЦД50/см3 відповідно.
Окрім того, в роботі використали ліпополісахарид (ЛПС-1), який застосовували як імуностимулятор у процесі імунізації тварин живою вакциною проти вірусної діареї, виготовлений за методом Красочко П.А., Машеро В.А.(1998) шляхом лужного гідролізу бактеріальної маси культури Bacillus alvei (штам 413) з колекції лабораторії вивчення хвороб бджіл ННЦ "ІЕКВМ".
За допомогою тест-культури Staphilococcus aureus (штам 209 Р) визначали фагоцитарну активність та фагоцитарне число нейтрофілів периферійної крові.
2.2. Культури клітин
Вірусологічні дослідження здійснені в культурах перещеплюваних клітин трахеї (ТрТ) і коронарних судин теляти (КСТ) та нирки новонародженого хом'ячка (ВНК-21/13), які підтримуються в колекції лабораторії біотехнології ННЦ "ІЕКВМ". Матричні розплідки перещеплюваних клітин, що отримували у вигляді їх суспензій у поживному середовищі, підтримували шляхом серійних пересівів.
2.3. Поживні середовища, розчини та хімреактиви
У дослідах з культивування клітин за стаціонарним (у матрасах) і ролерним (у флаконах і бутлях) способами накопичення їх біомаси використовували поживні середовища Ігла та 199, сироватку крові великої рогатої худоби після інактивації інгібіторів за температури 56 °С протягом 30 хвилин, виробництва ДП "Ветеринарна медицина".
Під час пересівів для зняття клітин зі скла за безцентрифужним способом користувалися розчинами трипсину та Версена у співвідношенні 1:9.
Вихідні значення концентрації водневих іонів (рН) поживних середовищ у процесі культивування клітин та вірусу становили 7,0 - 7,2. Корекцію концентрації водневих іонів здійснювали за допомогою стерильного 7,5 % розчину натрію двовуглекислого та льодяної оцтової кислоти.
Концентрацію та життєздатність клітин визначали експрес-методом фарбування трипановим синім і підрахування живих клітин у камері Горяєва. Для цього до 1 см3 суспензії клітин додавали рівний об'єм 1 % розчину трипанового синього і після старанного піпетування заповнювали камеру Горяєва пофарбованою суспензією клітин. Підрахунок здійснювали у всіх сітках і обчислювали середню кількість клітин за формулою:
Х = (2.1),
де Х-кількість клітин у 1 см3 досліджуваної суспензії;
А - кількість підрахованих живих (непофарбованих) клітин у камері Горяєва;
В - коефіцієнт розведення;
1000 - кількість кубічних міліметрів у 1 см3;
0,9 - об'єм лічильної камери Горяєва в кубічних сантиметрах.
Для спрощення підрахунку визначену середню кількість клітин, підрахованих у трьох камерах, множили на коефіцієнт 2200.
Життєздатність клітин у суспензії визначалася за кількістю живих (непофарбованих клітин) у процентному відношенні до загальної кількості клітин.
2.4. Тварини
Експериментальні дослідження з вивчення реактогенності, нешкідливості, антигенних та імуногенних властивостей виробничого штаму ВК-1М вірусу діареї та дослідних зразків вакцини виконувалися на 300 білих мишах масою 18 - 20 г, 60-морських свинках масою 300 - 400 г, 40 кроликах породи Шиншила масою 2,0 - 2,5 кг та 99 телятах 21-28-добового (n=36) та 3-4-місячного віку (n=63).
2.5. Адаптація та визначення інфекційної активності вірусу діареї
Адаптацію різних штамів вірусу діареї до перещеплюваних клітин здійснювали шляхом послідовних пасажів на випробуваних культурах з подальшим визначенням титру їх інфекційності. Культури клітин заражали після зливання ростового середовища та ополіскування моношару клітин невеликим об`ємом підтримуючого середовища для видалення залишків сироватки крові.
На початку адаптації випробуваних штамів вірусу діареї моношарові культури клітин заражали вірусовміщуючою культуральною суспензією з розрахунку 1:10 співвідношення її об`єму до об`єму підтримуючого середовища в культуральному посуді, поступово зменшуючи дозу зараження на підставі визначення множинності зараження з розрахунку на одну клітину, що виражали в ТЦД 50/клітину.
За деструкції 90-95 % клітин моношару припиняли інкубування і вірусовміщуючу біомасу в культуральних посудинах піддавали одноразовому заморожуванню - відтаванню. Після видалення клітинного детриту центрифугуванням за 2000 g упродовж 15 - 20 хвилин вірусовміщуючу культуральну суспензію використовували для наступного пасажу в культурі клітин. Таким чином здійснювали до 5-ти пасажів, у процесі яких зменшували об'ємну дозу зараження до співвідношення 1:25 (вірус:середовище), в якій від